“Перфторан”: революционная комбинация (стр. 1 из 3)

Андрей Артурович Недоспасов, д.х.н., Наталия Владимировна Беда, м.н.с., Институт молекулярной генетики РАН

“Нет ничего более практичного, чем хорошая теория” - фундаментальная наука неизбежно находит выход в практику. Увы, в родном отечестве эта аксиома все чаще оказывается теоремой, проблемой, а то и просто иллюзией. Быть может, фундаментальные исследования, описанные в этой работе, позволят восстановить статус-кво и минимизировать ущерб от возникшего дисбаланса.

Многие лекарственные препараты и методы лечения, открытые задолго до “эры NO”, в большей или меньшей степени влияют на метаболизм оксидов азота, но действие это часто остается незамеченным, а лечебные эффекты объясняются какими-то другими причинами. Яркий пример тому - клиническое применение искусственных кровезаменителей на основе перфторорганических соединений (ПФС), известных в России под названиями “Голубая кровь” и “Перфторан” [1-3].

Идея ПФС-кровезаменителей возникла в конце 60-х годов XX в. Поскольку жидкие ПФС прекрасно растворяют кислород, эмульсии из них могли бы выполнять газотранспортную функцию эритроцитов крови. Исследования активно велись в Японии, СССР и США. В 80-е годы, во время афганской войны, опытные партии советских препаратов спасли немало жизней раненым, обреченным на неминуемую смерть от потери крови. В настоящее время “Перфторан” допущен к клиническому применению и свободно продается в аптеках.

Со временем выяснилось, что применение “Перфторана”, в том числе в малых дозах, часто дает положительные эффекты, для которых связь с его газотранспортной функцией не просматривается. Одновременно обнаружили ряд побочных эффектов, также не находивших объяснения. Сегодня многие из них стали понятны благодаря представлениям о мицеллярном окислительном нитрозировании *. Этот термин, предложенный нами для введения радикала ·NO в гетерогенной среде, подразумевает, что в значительной степени реакции идут по радикальному механизму: молекула NO реагирует со свободным радикалом, образовавшимся из молекулы-мишени под действием ·NO2 - продукта окисления NO.

* Подробнее см.: Недоспасов А.А., Беда Н.В. Биогенные оксиды азота // Природа. 2005. №7. С.33-39.

Перфторуглеводороды (ПФУ) - экстремально гидрофобные вещества с большим коэффициентом распределения Q для кислорода и NO в смесях с водой. Кислород растворяется в них (в гидрофобной фазе эмульсии) гораздо лучше, чем в воде или плазме крови, из-за чего они и нашли применение в составе кровезаменителей. Благодаря мицеллярному катализу микрокапли эмульсии в крови действуют как губки для обоих газов, именно в них происходит теперь основная часть окисления NO.

В предыдущей статье мы рассматривали влияние гидрофобных фаз на процессы окисления NO (например, при образовании холестериновых бляшек на стенке кровеносного сосуда). При сравнении с эмульсией ПФС-кровезаменителей заметны три существенных отличия.

Во-первых, гораздо выше значения Q. Поскольку ускорение реакции окисления NO при введении оптимальных количеств гидрофобной фазы пропорционально QNO в присутствии “Перфторана” окисляется гораздо быстрее [4, 5]. При этом увеличиваются скорости нитрозирования и других процессов, зависимых от мицеллярного катализа, - все они протекают преимущественно в искусственной гидрофобной фазе или на границе раздела фаз. Концентрация NO в водной фазе первоначально падает, что приводит к активации ферментов NO-синтаз, поставляющих NO.

Во-вторых, капли эмульсии не смачивают стенки сосудов (перфторуглеводороды вообще ничего не смачивают из имеющихся в организме поверхностей раздела фаз). Более того, NO из холестериновых бляшек и других “обычных” гидрофобных фаз также частично переходит в капли эмульсии. Значит, повреждающее действие продуктов окисления NO на стенки сосудов уменьшается.

В-третьих, линейные размеры капель эмульсии в “Перфторане” менее 0.1 мкм (диаметр эритроцита ~20 мкм, а холестериновой бляшки много больше); соответственно, отношение поверхности к объему оптимально для протекания реакций нитрозирования на границе раздела. Если в окружающем пространстве присутствуют тиолы (RSH), капля эмульсии может действовать как миниатюрный реактор по производству тионитритов (RSNO). В норме в плазме крови довольно высокая концентрация восстановленного глутатиона (трипептида, содержащего остаток цистеина со свободной HS-группой), нитрозоформа которого - прекрасный донор NO.

Таким образом, аналогия капли перфторуглеводородной эмульсии с эритроцитом оказалась гораздо глубже, чем полагали сначала: оба переносят и кислород, и углекислый газ, и NO/RSNO. Понятно, что даже малые дозы кровезаменителей типа “Перфторана”, введенные в кровяное русло, обладают эффектом, характерным для нитроглицерина (основы динамита и одновременно популярного лекарства), т.е. вызывают релаксацию сосудов и восстанавливают кровообращение.

В первых опытах на крысах было наглядно продемонстрировано влияние эмульсий перфторуглеводородов на метаболизм NO: при введении “Перфторана” наблюдались предсказанные колебания концентраций нитрита и нитрата в плазме, изменения частоты сердечных сокращений, обычные при действии вазодилаторов типа нитроглицерина. Ингибирование NO-синтаз снимало эти эффекты [6]. Несколько лет спустя эту работу повторили в США [7].

Побочные эффекты применения кровезаменителей типа “Перфторан” во многих случаях проявлялись не сразу, а спустя значительное время после переливания крови. Поверхностно-активные вещества, используемые для стабилизации эмульсий при создании ПФУ-кровезаменителей, выводятся из организма гораздо быстрее, чем сами ПФУ (характерные времена - сутки и месяц соответственно). Если в первые часы после введения эмульсия становится основным местом окисления NO, то через сутки процессы перемещаются главным образом в естественные липидные фазы организма, в которых растворились ПФУ. Ясно, что в организме они (в виде отдельной фазы или растворенные в имеющихся гидрофобных фазах) будут влиять не только на параметры мицеллярного окисления NO из-за роста QO2 и, особенно, QNO, но и на все последующие процессы, включая нитрование и нитрозирование липидов, белков и нуклеиновых кислот. Таким образом, “отравления” под действием химически инертных перфторуглеводородов, в том числе газообразных, растворяющихся в липидах, можно объяснить потерей устойчивости системы регуляции метаболизма оксидов азота.

Рис.1. Схема биосинтеза NO и основные метаболические пути оксидов азота.

Ускорение окисления NO кислородом отражается на равновесии высших оксидов азота; при этом их стационарные концентрации меняются. Если электрофильное нитрозилирование (образование RSNO, рис.1) преимущественно протекает под действием NO+ (N2O3, N2O4), а радикальные реакции (включая нитрование и окисление белков и нуклеиновых кислот) - под действием ·NO2, то при использовании искусственных гидрофобных фаз в качестве кровезаменителей желательно сместить равновесие в сторону первых, во всяком случае не увеличивать стационарные концентрации NO2.

Концентрации высших оксидов азота при окислении NO чрезвычайно низки, и измерить их обычными методами не удается. Мы нашли простой и чувствительный способ, основанный на определении нитрата в продуктах окисления. Нитрат восстанавливается в нитрит соединениями ванадия, скорость этого процесса измеряют с помощью реакции Грисса (по образованию красителя). Если из образца удалить имевшийся первоначально (до восстановления нитрата) нитрит, весь образовавшийся краситель будет происходить из нитрата. Поскольку в результате гидролиза N2O3 получается только нитрит

N2O3 + H2O = 2HNO2, (1)

а при гидролизе N2O4 - эквимолярная смесь нитрита и нитрата

N2O4 + H2O = HNO2 + HNO3, (2)

доля нитрата в продуктах будет мерой стационарных концентраций обоих оксидов. В целом, в малополярных гидрофобных фазах стабилизация N2O3 при сольватации минимальна, распад на NO и NO2 усиливается, и доля NO2 должна расти:

NO2 + NO = N2O3. (3)

Анализ системы уравнений для стационарных концентраций оксидов азота показал, что возможно снижение [NO2]ст независимо от изменений [NO]ст и общего пула оксидов азота [8]. В частности, избирательно ускоряя нитрозилирование, мы снижаем не только [N2O3]ст, но и [NO2]ст, т.е. скорости всех радикальных реакций с его участием. В этой связи поиск катализаторов нитрозилирования/денитрозилирования становится важной задачей биохимии.

Рис.2. Гистограмма, отражающая вклад гетерогенности среды и катализаторов денитрозирования в баланс нитрит/нитрат при окислении NO. Слева: в гетерогенной среде скорость окисления NO выше, чем в гомогенной. Обычно система равновесий высших оксидов азота сдвигается в сторону NO2 и N2O4, и доля нитрата в продуктах возрастает. Triton X 100 - детергент (аналог мыла), использованный для получения липосом (по данным Liu et al., 1998). Справа: хотя в CF-эмульсиях скорость окисления NO возрастает сильнее, чем в обычных липидах, сольватация и скорости гидролиза высших оксидов азота изменены. В присутствии “Перфторана” доля нитрата в продуктах ниже, чем в гомогенном водном растворе (левая пара столбиков). Фосфат (PO4– 3 ), пиро- (P2O7–4 ) и триполифосфат (P3O10–5 ) ускоряют гидролиз N2O3 в нитрит. В результате стационарные концентрации NO2 и N2O4 уменьшаются и выход нитрата падает. Видно, что полифосфат гораздо активнее, чем фосфат. Hepes - компонент буферного раствора.

Сравним влияние гетерогенности среды и сольватации на нитрит-нитратный баланс в продуктах окисления NO в присутствии обычных липидов и в “Перфторане” (рис.2). Видно, что в первом случае при добавлении гидрофобной фазы доля нитрата (а значит, вызываемых ·NO2 радикальных реакций!) растет, во втором оказывается ниже, чем в гомогенном водном растворе [9]. Отчасти эффект связан с каталитическим действием полиэфирного стабилизатора эмульсии на реакцию нитрозирования. Его можно усилить с помощью других найденных нами катализаторов. На рис.2 в качестве иллюстрации показаны каталитические эффекты фосфата и триполифосфата. При увеличении скорости гидролиза N2O3 (фактически - нитрозилирования воды) уменьшаются стационарные концентрации как N2O3, так и NO2 из-за сдвига равновесия в реакции (3).