Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у жи (стр. 1 из 19)

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия

Кафедра физиологии сельскохозяйственных животных и зоологии

Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у животных

Ульяновск, 2005 г.

УДК

Н.А.Любин, Л.Б.Конова.

Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у сельскохозяйственных и лабораторных животных при патологиях.

Для студентов и аспирантов факультетов ветеринарной медицины и технологического. Ульяновск, ГСХА, 2005, с.

При подготовке настоящих рекомендаций был использован опыт работы…

РЕЦЕНЗЕНТ: В.А.Ермолаев, доктор ветеринарных наук, профессор

Рекомендовано к изданию

методической комиссией

факультета ветеринарной медицины

Протокол № от 2005 г.

Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия, 2005 г

МЕТОДИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ МАЗКОВ КРОВИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

А. ВЗЯТИЕ КРОВИ И ПОЛУЧЕНИЕ МАЗКА

Циркулирующая в сосудистой системе кровь представляет более или менее равномерную взвесь в плазме форменных элементов: эритроцитов, лейкоцитов и кровяных пластинок (у птиц, рептилий и амфибий — тромбоцитов). Абсолютное количество и соотношение отдельных групп клеток в крови различных видов животных неодинаковы. Наибольшие колебания дают эритроциты: от 3,5 млн. в 1 мм ³ крови кур до 14,4 млн. в том же объёме крови коз. Несколько меньше видовые колебания количества белых кровяных телец: в 1 мм ³ крови млекопитающих содержится от 5 до 15 тыс. лейкоцитов. Количество лейкоцитов в крови птиц значительно выше: у кур, например оно, доходит до 35 тыс., а у гусей до 38 тыс. в 1 мм ³. Наконец, содержание кровяных пластинок в 1 мм³ крови колеблется от 200 до 400 тыс.

В крови, взятой из различных участков сосудистой системы, находится далеко не одина- ковое количество кровяных телец, особенно, и это наиболее важно, лейкоцитов. Значительно колеблется при этом и соотношение отдельных форм белой крови (табл.1,2).

Таблица1

Количество лейкоцитов в различных участках кровяного русла у кроликов

Название органа или сосуда, ткани	%	Название органа или сосуда, ткани	%
Паренхима печени	83,9	Лёгкие .	74,4
Паренхима селезенки	385, 3	Vena. Pulmon.	43,9
Почки	103,8	Мышцы сердца	61,7
Надпочечники	73,8	Костный мозг	128,29
Vena mesent.	89,0	Vena. femoralis	62,4
Art. mesent.	84,4	Аrt . femoralis	69,9
Vena cava caud.	4.9	Vena. renalis	60,5

Если принять среднее количество лейкоцитов в 1 мм³ крови из ушной вены за 100%, то в крови из сосудов других органов содержится:

Поэтому важно брать кровь для анализа всегда из одного и того же сосуда или группы сосудов. У всех сельскохозяйственных млекопитающих таким местом являются вены уха, у кур — гребень, у уток и гусей — мякоть ступни ноги.

Таблица 2 Состав белой крови свиней

Кровь	Базофилы	Эозино-филы	Нейтрофилы			Лимфо-циты	Моноциты
			Юные	Палочко ядерные.	Сегменто ядерные.
Из вены уха	0,5	2,5	1,0	5,5	31,5	55,5	3,5
Из сердца	до 0,1	0,4	1,0	10,0	62,0	24,5	4,0

Количество лейкоцитов зависит и от физиологического состояния животного.

У многих сельскохозяйственных и лабораторных животных заметно выражены пищеварительный лейкоцитоз (особенно у собаки), менее у лошади, и колебания количества лейкоцитов и (особенно) эритроцитов при мышечной работе. При некоторых патологических состояниях имеет место ретенция белых кровяных телец в сосудах печени и надпочечника. Лейкоцитоз наблюдается также во второй половине беременности.

Место взятия крови тщательно выстригается и если нужно, промывается водой с мылом, затем спиртом (или спиртом с эфиром). Рекомендуется тщательно растирать место взятия крови ваткой со спиртом и эфиром, что вызывает местную гиперемию и вместе с тем помогает избежать случайных колебаний лейкоцитарной формулы, связанных с некоторым застоем крови в мелких венах уха. Особенно следует иметь в виду возможное избирательное скопление в них эозинофилов.

Хорошие мазки крови можно получить только на очень чистых, обезжиренных предметных стёклах, тщательно промытых сначала горячей водой с мылом, а затем, после высушивания, — спиртом с эфиром. Промывание в спирте с эфиром особенно важно для полного обезжиривания стёкол. Если используются уже бывшие в употреблении стёкла, то их необходимо предварительно прокипятить в воде с содой.

Прокол тканей для получения крови лучше всего производить иглой Франка, но можно употреблять и обыкновенную иглу или специальное перо для уколов.

Первую выступившую на поверхность каплю крови быстро и тщательно стирают с места укола, а из второй и последующих приготовляют мазки.

Приготовление мазка крови. Чистое предметное стекло держат, как показано на рисунке 1, между большим и средним пальцами левой руки. В правой руке, теми же или большим и указательным пальцами держат чистое покровное или тонкое шлифованное предметное стекло. По крайней мере, одно ребро таких стёкол должно быть уже ширины того предметного стекла, на котором приготовляют мазок. Обычно это достигается подбором или обламыванием углов шлифованного стекла.

Рис. 1. Приготовление мазка крови.

Поверхностью предметного стекла, зажатого в левой руке, осторожно, но быстро касаются выступившей из прокола капли крови, стараясь сделать это ближе к среднему пальцу и, сейчас же, приведя стекло в горизонтальное положение, прикладывают к его поверхности узкое ребро того стекла, которое держат в правой руке. Приложенное ребро должно лежать перпендикулярно к длинным граням предметного отекла, а самое приложенное стекло нужно наклонить в сторону капли под углом в 40—50°. Держа это стекло, таким образом, осторожно двигают его в сторону капли до соприкосновения с нею. Как только капля, коснувшись подвижного стекла, разойдётся по линии соприкосновения стёкол, верхнее наклонное стекло быстрым, но ровным движением направляют обратно, в сторону большого пальца, сохраняя всё время прежний угол наклона в 40—50°. Полученный таким способом мазок высушивают на воздухе и на нём пишут иглой название или номер животного, его пол ((J или Q), и дату взятия крови.

Можно изготовлять мазки и на покровных стёклах. Для этого одним покровным стеклом берут очень маленькую каплю крови и прикладывают к нему другое покровное стекло так, чтобы углы одного стекла легли на середину рёбер другого. Как только капля крови разойдётся тончайшим слоем между обоими стёклами, последние параллельным

движением в противоположные стороны разводятся, и, таким образом, получаются два мазка.

В. ФИКСАЦИЯ МАЗКА

Чтобы закрепить все форменные элементы крови в препарате с максимально возможным сохранением их структуры и подготовить мазки к последующей окраске, существуют различные методы фиксации мазков. Наибольшее практическое значение имеют:

1. Фиксация абсолютным метиловым спиртом. Это лучший метод фиксации. Сухие мазки на 3 минуты погружаются в абсолютный метиловый спирт или на то же время спирт наливается на мазок, вполне покрывая препарат. Через 3 минуты мазки вынимают (или сливают с них спирт) и просушивают на воздухе.

2. Фиксация абсолютным этиловым спиртом, смешанным с равным количеством эфира. Фиксация длится 10—30 минут в обычных сосудах для гистологических растворов. Этот способ значительно хуже, так как даёт много артефактов.

В. ОКРАСКА МАЗКА. ОСНОВНОЙ МЕТОД ОКРАСКИ ПО РОМАНОВСКОМУ

Посредством окраски препарата наиболее отчетливо выявляется тончайшая структура, как ядра, так и цитоплазмы. Принцип современных методов окраски мазков крови открыт в 1891 г. Д. Л. Романовским и заключается в избирательном поглощении (химическом и коллоидальнохимическом) веществами клетки трёх красящих веществ — азура метиленовой синьки и эозина. Азур («красная из метиленовой синьки») имеет амфотерноосновную реакцию, метиленовая синька — щелочную, эозин — кислую.

Ядро клетки, богатое нуклеопротеидами и нуклеотидами, базофильно, т. е. окрашивается основными красками с избирательным поглощением а з у р а.

Цитоплазма молодых клеток, относительно богатая нуклеиновыми кислотами (нуклеотидами), также, хотя и в меньшей степени, базофильна. При этом избирательно поглощается преимущественно метиленовая синька. Цитоплазма же многих зрелых клеток крови (прежде всего нейтрофилов) ацидофильна (оксифильна).

Лимфоциты сохраняют базофилию цитоплазмы на всех стадиях развития, избирательно поглощая метиленовую синьку. Наличие базофилии молодой цитоплазмы, указывающее на относительное богатство её нуклеиновыми кислотами, связано с сохранением способности молодых клеток к интенсивному синтезу белков.

Лимфоциты сохраняют эту способность на весь онтогенез.

Базофилия гранул базофилов определяется наличием в них кислой слизи (мукоитиносерная кислота).

В лабораторной практике чаще всего пользуются следующими способами окраски по методу Романовского.

Окраска раствором Гимза

Краска Гимза, применяемая при окраске по методу Романовского, представляет собой комбинацию метилен-азура (азур II) и эозина (В, жёлтого). Она состоит из азура II*—3,0, эозина В —0,8, химически чистого глицерина 250,0 и метилового спирта 250,0.