Смекни!
smekni.com

Являются ли вирусы живыми организмами (стр. 7 из 19)

Проникновение фагового генома в клетку сопровождается физическим отделением нуклеиновой кислоты от большей части капсидных белков, которые остаются снаружи.

Кроме фаговой нуклеиновой кислоты внутрь бактериальной клетки инъецируется также небольшое количество белка и некоторые другие вещества, в том числе олигопептиды и полиамины. Роль этих веществ в процессе развития фага неизвестна, некоторые из них являются остатками протеолиза капсидных белков при сборке вирионов. Если бактериальные клетки способны поглощать свободную ДНК из среды, то и геном фага может проникнуть в них в виде свободных молекул ДНК. Это явление называют трансфекцией. Способность бактерий поглощать молекулы ДНК может возникнуть как нормальное явление на некоторых этапах роста, что наблюдается, например, у В subtilis.

В некоторых случаях такое состояние вызывается искусственно, как, например, у Е coli.

Процесс развития фага после трансфекции принципиально не отличается от происходящего при нормальной фаговой инфекции, за исключением того, что в этих случаях не наблюдается резистентности, вызываемой отсутствием рецепторов или другими свойствами оболочки клетки.

Проникновение генома фага в чувствительную к нему бактерию приводит либо к лизогенной, либо к литической инфекции, в зависимости от природы фага (а иногда и бактерии) и от окружающих условий, например температуры. При лизогенном типе взаимодействия геном фага в неинфекционной форме передается бактериальными клетками из поколения в поколение, причем время от времени в некотором количестве клеток синтезируются соответствующие вирионы, лизирующие эти клетки и выходящие затем во внешнюю среду. Лизогенные клетки, повторно зараженные этими вирионами, не лизируются (ибо они иммунны к этому фагу), так что лизогенная культура продолжает нормально расти. Присутствие свободных вирионов можно выявить путем воздействия на клетки каких-либо иных, нелизогенных штаммов бактерий, лизируемых данным фагом. Фаги, способные лизогенизировать заражаемые ими бактерии, называются умеренными, а фаги, у которых такая способность отсутствует, - вирулентными. Следует, однако, помнить, что даже умеренные фаги при первой инфекции чувствительных к ним бактерий вызывают продуктивную инфекцию у многих или даже у всех клеток. Возникновение лизогении и предупреждение созревания вирионов и лизиса клеток требуют серии определенных событий, которые вовсе не всегда случаются со всякой зараженной бактерией. Вероятность появления лизогении или продуктивной инфекции варьирует от фага к фагу и зависит от условий культивирования.

Связь между строением вириона и началом инфекции

Длинные нити (фибриллы) отростка служат для специфического узнавания фагом определенных участков на поверхности клетки-хозяина, к которым он прикрепляется. Мутации генов, кодирующих белки нитей, приводят к изменению или полной утрате способности фага прикрепляться к клетке-хозяину. Еще одним доказательством важной роли нитей отростков служат эксперименты с антифаговыми антисыворотками, показавшими что прикреплению фага к клеткам препятствуют только антитела к белкам дистальных частей концов нитей.

Нити обвиваются вокруг отростка таким образом, что их средняя часть поддерживается “усиками”, прикрепленными к тому месту, где головка соединяется с отростком. Синтез белка “усиков”, вероятно, кодируется геном wac. Соприкосновение концов нитей с рецептором клетки, возможно, обусловливает их разворачивание и выпрямление. Отличительное свойство фага Т4, которое легко утрачивается вследствие мутации и отбора, заключается в том, что освобождение нитей отростка от “усиков” зависит от L- триптофана как кофактора. Зависимость выпрямления нитей и последующего прикрепления фага к клетке от концентрации триптофана указывает на то, что контакт некоторых нитей с клеткой может способствовать освобождению остальных нитей. Для следующего этапа взаимодействия фага с бактерией необходимо правильное пространственное положение базальной пластинки отростка, что в свою очередь, обеспечивается, вероятно, контактом всех шести нитей с рецепторами клетки. По-видимому, прикрепление фаговой частицы с помощью нитей отростка позволяет ей производить определенные скользящие движения по поверхности клетки, пока не будет найден участок, через который можно ввести ДНК. В этом отношении весьма важным оказалось наблюдение, согласно которому необратимое прикрепление фага к клетке и проникновение в нее его ДНК происходят лишь на определенных участках оболочки (всего их около 300), где цитоплазматическая и внешняя мембраны образуют прочные контакты, устойчивые к мягкому осмотическому шоку. Это справедливо, вероятно, и для других бактериофагов. Весьма важно было бы выяснить, каково отношение этих участков к местам синтеза мембранных компонентов и фаговых рецепторов. На следующем этапе взаимодействия фага с клеткой происходит сокращение чехла отростка, в результате чего стержень проникает в клеточную оболочку. Сокращение стимулируется базальной пластинкой, изменяющей свою конформацию под влиянием нитей отростка. В процессе сокращения принимают участие все 144 субъединицы чехла, и их совместное перемещение приводит к уменьшению длины чехла в два раза. Было высказано предположение, что энергия для сокращения чехла поставляется молекулами АТФ, ассоциированными с фагом, однако окончательно это еще не доказано. Дистальная часть стержня подводится вплотную к внутренней цитоплазматической мембране, но не обязательно проникает через нее. ДНК из обработанных мочевиной фагов, имеющих сокращенные чехлы и экспонированные стержни, может проникать в сферопласты Е coli, у которых внешние мембраны и жесткие оболочки либо совсем удалены, либо в значительной мере разрушены. Заражение сферопластов, осуществляемой в гипертонических средах, приводит к образованию нормального фагового потомства. В сферопласты можно вводить цельные или фрагментированные молекулы фаговой ДНК, которые затем реплицируются и участвуют в рекомбинации.

Естественно, что в процессе заражения сферопластов поверхностные рецепторы не участвуют. Поэтому обработанные мочевиной фаги Т4 могут заражать устойчивые к ним мутанты Е. Coli или даже устойчивые бактерии отдаленных видов. Прикрепление к сферопластам фаговых частиц, обработанных мочевиной, блокируется фосфатидилглицерином, который, вероятно, является составной частью мембран, стимулирующей введение ДНК в клетку.

Если бактерию, уже зараженную Т-четным фагом, спустя несколько минут вновь инфицируют этим же фагом, то второй контингент фага не участвует в размножении (так называемое исключение при суперинфекции) и не передает своей ДНК потомству. Было показано, что ДНК фаговых частиц, попавших в клетку при повторном заражении, разрушается (разрушение при суперинфекции). Оба этих процесса находятся под контролем активируемых в клетке-хозяине фаговых генов, функция которых может нарушаться при соответствующих мутациях.

Сборка вирионов

В отличие от ранних этапов развития фага ход сборки капсидов и полных вирионов не программируется последовательной экспрессией фаговых генов. По-видимому, все белки вириона и другие поздние белки, как, например, лизоцим фага, синтезируются более или менее одновременно и, накапливаясь, образуют “фонд предшественников”. Отсюда они извлекаются путем прямого специфического взаимодействия с другими белковыми молекулами, в результате чего возникают субструктуры, которые затем собираются уже в цельные вирионы. Общий ход сборки стал понятен из результатов опытов in vivo с мутантными фагами и при изучении лизатов; однако после того, как была открыта возможность сборки предобразованных фаговых предшественников in vitro, с помощью этого эффективного метода было получено много новых данных. Сборка вириона состоит из четырех основных этапов, приводящих к образованию промежуточных структур, взаимодействующих между собой лишь в определенных критических точках.

Базальная пластинка фагового отростка построена из 15 белков, в синтезе которых , кроме основных ,участвуют и некоторые другие гены. Весьма интересно, что пластинка содержит, по-видимому, несколько молекул двух кодируемых фагом ферментов - дигидрофолатредуктазы и тимидилатсинтетазы, а также некоторое количество фолиевой кислоты.

Собранная базальная пластинка после присоединения к ней белка гена Б4 служит затравкой для сборки стержня отростка, состоящего из 144 молекул продукта гена 19. Вокруг стержня происходит сборка чехла, представляющего собой полимер, построенный из 144 молекул продукта гена 18. Продукты двух других генов стабилизируют всю эту структуру. Непонятно, каким образом достигается постоянство длины стержня при сборке. Возможно, что существуют еще какие-то линейные белки, отмеряющие нужное расстояние, или контакт с базальной пластинкой придает субъединицам стержня такую специфическую конформацию, которая имеет минимум свободной энергии только в случае определенного размера стержня. Эта последняя гипотеза указывает на то, что процесс сборки, возможно, не является чисто механическим.

Оболочка фаговой головки, построенная из более чем 10 белков, образуется в результате активности многих генов. Основной из них представляет собой продукт гена 23, входящий в состав законченной головки лишь после отщепления от основного полипептида фрагмента с мол. весом 10000. Протеолиз осуществляется главным образом продуктом гена 22, а также, возможно, гена 21, отсутствующим в зрелом вирионе. Однако белок гена 22 представляет собой, по существу, внутренний белок, превращающийся в ,конце концов, в результате самопереваривания в мелкие пептиды, причем некоторые из них остаются в головке фага. Здесь присутствуют также и другие внутренние белки, подвергающиеся частичному перевариванию белком гена 22.