НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ
ГІЛЬЧУК Юлія Миколаївна
УДК 577.21 : 577.213.3 : 577.215
577.217 : 577.218
ЕФЕКТИ, ОБУМОВЛЕНІ ВВЕДЕННЯМ У КЛІТИНИ ССАВЦІВ ТРАНСГЕНА АПОЛІПОПРОТЕЇНУ А-1 ЛЮДИНИ
03.00.22 - молекулярна генетика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ − 2008
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (м. Київ).
Науковий керівник:
доктор біологічних наук, професор,
член-кореспондент НАН України, академік АМН України
Кордюм Віталій Арнольдович,
Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,завідувач відділу регуляторних механізмів клітини.
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Строковська Людмила Іванівна,
Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,провідний науковий співробітник відділу біохімічної генетики;
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Літошенко Олександр Якович,
Інститут геронтології АМН України, керівник лабораторії молекулярної та клітинної біології.
Захист дисертації відбудеться «24» червня 2008 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м.Київ, вул. Академіка Заболотного, 150.
Автореферат розіслано « 24 » травня 2008 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук О.В. Підпала
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Останні роки інтенсивно розвиваються дослідження, які спрямовані на корекцію певних генетичних дефектів введенням цільових генів у клітини реципієнта – генна терапія (ГТ) (Vermaetal., 2005). ГТ, як напрямок, сформувалася на перетині молекулярної генетики та медицини і спочатку була зосереджена на лікуванні спадкових моногенних захворювань, таких, як дефіцит аденозиндезамінази, муковісцидоз, гемофілія, дефіцит α-1 антитрипсину та інших (Patiletal., 2005). На сьогодні генно-терапевтичні дослідження поширились на полігенні та інфекційні захворювання; більше 60 % клінічних випробувань ГТ стосуються терапії злоякісних пухлин, велика кількість зусиль спрямована на лікування синдрому набутого імунодефіциту (Edelsteinetal., 2007). Для медичного використання схвалено перший препарат «Gendicine» (SiBiono Genetech, Китай) (Pangetal., 2005) для лікування різних форм раку.
Прикладом полігенного захворювання, для якого інтенсивно розробляють схеми генно-терапевтичної корекції на стадії доклінічних досліджень, є атеросклероз. Атеросклероз − одне із найпоширеніших захворювань у світі, проявами якого є звуження просвіту судин внаслідок порушення метаболізму ліпідів та, як наслідок, обмеження кровообігу до життєво важливих органів (Оганов и соавт., 2002). Першим кандидатом для ГТ атеросклерозу людини є ген основного білка ліпопротеїдів високої густини (ЛПВГ) − аполіпопротеїну А-1 (АРОА1) (Eckardsteinetal., 2001).
Основними проблемами як для підходів генно-терапевтичної корекції атеросклерозу, так і загалом для ГТ, є необхідність підвищення ефективності та тривалості функціонування в організмі рекомбінантних векторів, які містять терапевтичний ген, зниження їхньої токсичності, імуногенності та інших можливих негативних ефектів.
Для доставки гена АРОА1 людини invivo вже використовували рекомбінантні вірусні вектори, комплекси плазмід із такими носіями, як модифікований полі-L-лізин, ліпосоми та інше. У роботах (Okaetal., 2007; Lebherzetal., 2007) авторами з використанням рекомбінантних аденовірусних векторів (рАд) та векторів на основі адено-асоційованого вірусу (рААВ) показано можливість забезпечення високого рівня синтезу АРОА1 людини у піддослідних мишей, який утримувався після одноразового введення вектора майже два роки. У той же час, застосування вищезазначеної системи рАд векторів для ГТ атеросклерозу на кролях продемонструвало низьку ефективність (Snoeysetal., 2007; Lievensetal., 2004). Використання рекомбінантних вірусних векторів для повторюваних введень цільового гена часто неефективне через продукування нейтралізуючих антитіл (Monhanetal., 2000; Amalfitanoetal., 2002). Крім того, безпечність використання вірусних векторів є нагальною проблемою ГТ та робить актуальним розробку саме невірусних засобів доставки цільових генів.
З іншого боку, спроби доставки цільової ДНК з геном АРОА1 людини в організм мишей з використанням таких носіїв, як галактолізований полі-L-лізин (Диже и соавт., 2001; Перевозчиков и соавт., 1997), забезпечили низький рівень експресії трансгена, хоча було показано ефективність повторних ін’єкцій препаратів. Введенням гідродинамічною ін’єкцією плазмідної ДНК вдалось досягнути у десятки разів вищого рівня експресії АРОА1 людини у піддослідних тварин (Акифьев и соавт., 2004) порівняно з зазначеними раніше носіями. Однак, зазначений метод переносу ДНК є небажаним для ГТ атеросклерозу людини, особливо, для пацієнтів із серцево-судинними захворюваннями.
Одним із найефективніших носіїв для доставки плазмідних векторів in vivo є поліетиленімін (ПЕІ) (Boussifetal., 1995). Однак, при введенні комплексів ДНК/ПЕІ внутрішньовенною ін`єкцією експресію трансгена виявляють переважно у тканинах легенів (Goulaetal., 1998). З іншого боку, описано чимало випадків ефективного переносу плазмідної ДНК у комплексі з ПЕІ при локальному введенні препарату (Goulaetal., 1998). Рівень експресії введених у клітини ссавців генів залежить від багатьох чинників, у тому числі і від сили елементів регуляції транскрипції трансгена. У випадку необхідності забезпечення високого рівня експресії трансгена перспективним вважається його розміщення у векторі під контролем сильних промоторів.
Таким чином, актуальним є вивчення експресії гена АРОА1 людини in vitro та in vivo при введенні рекомбінантної плазмідної ДНК у комплексі з ПЕІ, а також встановлення впливу на рівень експресії гена АРОА1 людини сильних гібридних промоторів.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках плану фундаментальних досліджень відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за бюджетною темою 2.2.4.3. „Вивчення на модельних об’єктах очікуваних терапевтичних ефектів, обумовлених введенням рекомбінантних молекул” (№ державної реєстрації 0103V000075, 2003-2007 pp.).
Мета та завдання дослідження: Метою даної роботи є дослідження експресії клітинами СНО-К1 гена АРОА1 людини, який знаходиться у складі рекомбінантних плазмід під регуляцією різних сильних промоторів, вивчення експресії, тривалості знаходження та локалізації трансгена АРОА1 людини в організмі піддослідних тварин.
Для досягнення цієї мети поставлено такі завдання:
1. Створити рекомбінантні плазміди, які містять ген АРОА1 людини під контролем енхансеру/промотору середньораннього гена цитомегаловірусу людини з інтроном А цього ж гена (hCMV-ІA) та енхансеру середньораннього гена цитомегаловірусу людини, промотору та першого інтрону гена β-актину курчати (CAG), для експресії в клітинах ссавців in vitro та in vivo.
2. Одержати трансфіковані клітини культури клітин яєчників китайського хом’яка (СНО-К1) при використанні невірусного методу доставки цільової плазмідної ДНК.
3. Дослідити експресію гена АРОА1 людини трансфікованими клітинами СНО-К1, одержаними для різних рекомбінантних плазмід.
4. Розробити експериментальну модель для дослідження експресії трансгена АРОА1 людини in vivo.
5. Дослідити експресію гена АРОА1 людини, локалізацію та тривалість його знаходження в організмі піддослідних тварин при використанні невірусного методу доставки цільової ДНК.
Об’єктом дослідження є експресія трансгена АРОА1 людини in vitro та in vivo, локалізація та тривалість знаходження трансгена в організмі піддослідних тварин.
Предметом дослідження є ген АРОА1 людини, що знаходиться в рекомбінантних плазмідах під контролем різних елементів регуляції транскрипції.
Методи дослідження – мікробіологічні (нарощування і культивування бактерій, трансформація бактерій), генно-інженерні (полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), зворотна транскрипція, виділення і рестрикційний аналіз плазмідної ДНК, конструювання рекомбінантних ДНК, гель-електрофорез ДНК), молекулярно-біологічні (експресія білків), імунохімічні (ферментний імуносорбентний аналіз (ELISA), Вестерн-блот аналіз), біохімічні (електрофорез білків), мікроскопія.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше сконструйовано серію рекомбінантних плазмід, які містять повнорозмірний варіант гена АРОА1 людини під транскрипційним контролем промоторів енхансеру/промотору середньораннього гена цитомегаловірусу людини (hCMV-ІЕ), hCMV-ІA та CAG. Вперше показано можливість доставки рекомбінантних плазмід із геном АРОА1 людини у клітини ссавців ін’єкцією комплексів плазмідна ДНК/ПЕІ у паренхіму печінки. Вперше досліджено характер локалізації та тривалість знаходження гена АРОА1 людини в організмі піддослідних тварин при введенні плазмідної ДНК у складі комплексів з ПЕІ.
Практичне значення одержаних результатів. Одержано стабільно трансфіковані клони культури клітин СНО-К1, що продукують білок АРОА1 людини. Оптимізовано методи імунохімічної детекції АРОА1 людини у плазмі крові трансфікованих тварин. Результати дослідження можуть бути використані при розробці підходів до генно-терапевтичної корекції атеросклерозу, заснованої на використанні невірусної системи доставки цільової ДНК.