Смекни!
smekni.com

Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов (стр. 3 из 5)

1.5.3 Анализ структурных вирусных полипептидов

В большинстве случаев проводится электрофорез в пластинах полиакриламидного геля в присутствии ДДС-Na, как было описано впервые Даймэком и Ватсоном. Модификация данного метода изложена в работе. Гели окрашивают кумасси бриллиантовым синим, а для авторадиографического анализа экспонируют с рентгеновской пленкой. На рис. 6 представлены спектры структурных полипептидов ВПГ-1 и ВПГ-2, полученные гель-электрофорезом. Другие характеристики этих полипептидов приведены в табл. 1.


Таблица 1. Свойства и номенклатура некоторых белков ВПГ-1 и ВПГ-2

ВПГ-2 Свойства ВПГ-1
номер белка структурный вирусный белок молекулярная масса молекулярная масса структурный вирусный белок номер белка
ICSP 5–8 ICSP 9ICSP 10ICSP 11ICSP 12ICSP13–15ICSP 22 NNISP34–35NN NNICSP 46–47 NS VP5 NS NSVP7–8,5NSNNNSNS NNVP22–23 182–186157153146143 126–14085–90925442 4 5328–30 Предранний фос-фопротеинОсновной белок капсидаРибонуклеотидре-дуктазаОсновной ДНК-связывающий белокГликопротеины gA, gBЩелочная нуклеа-заГликопротеин gEБелок, ассоциированный с ДНК-полимеразойТимидинкиназаГликопротеин gD, ответственный за перекрестную нейтрализацию между ВПГ-2 иВПГ-1Белок капсида 175 155149 132 112–12685–90804844 5930–33 NS VP5 NS NSVP7–8,5NSNNNSNS VP18VP22–23 ICP 4 ICP 5 ICP 6 ICP 8ICP 9–14ICP 19NNICP 29NNICP 31ICPJ39–40

1.6 Другие а-герпесвирусы

В нашей лаборатории выращены и очищены и многие другие а-герпесвирусы, включая: вирус мамиллита крупного рогатого скота; вирус псевдобешенства; вирус герпеса лошадей типа 1; вирус ринотрахеита кошек; вирус кошачьего сомика. С этими вирусами работают практически так же, как и с вирусами простого герпеса. Поэтому ниже мы отметим только особенности работы с каждым из перечисленных выше вирусов.

1.6.1 Вирус мамиллита крупного рогатого скота и вирус псевдобешенства

Эти вирусы дают на клетках ВНК высокие титры, которые легко определить суспензионным методом, предложенным Расселом. Для очистки вирусов клетки ВНК заражают с высокой множественностью инфекции и культивируют при 37°С 24 ч или 48 ч. На этой стадии вирусы могут быть очищены. Таким образом, получают качественные препараты оболочечных вирусов, белковый спектр которых представлен на рис. 7.

1.6.2 Вирус герпеса лошадей типа 1

Рестрикционный анализ показывает, что разные штаммы EHV-1 могут принадлежать как субтипу 1, так и субтипу 2. Первый связан с выкидышами у кобыл, хотя выделяют его и из респираторного тракта. Второй относится к вирусам "респираторного типа" и не связан с выкидышами. Вирусы субтипа 1 размножаются во многих культурах. В нашей лаборатории мы обычно используем клетки линии RK13, хотя в других лабораториях предпочитают использовать клетки лошадей. Кроме того, вирусы субтипа 1 успешно размножаются в культурах клеток L-M. Некоторые штаммы субтипа 1 были адаптированы к росту на хомяках. Вирусные изоляты субтипа 2 растут только в клетках лошадей. Используя метод 1, можно проводить очистку вирусов обоих субтипов. На рис. 7 показаны спектры полипептидов EHV-1, BMV, PRV, ВПГ-1 и ВПГ-2.

1.6.3 Вирус ринотрахеита кошек

Этот вирус специфичен для клеток кошачьего происхождения. Культивируют его так же, как и ВПГ-1. Для наращивания вируса мы используем, как правило, линию клеток кошки, представленную д-ром П. Тэлботом, однако можно использовать эмбриональные клетки легкого кошки, полученные доктором О. Джэр-ретом и поставляемые фирмой FlowLaboratories, Irvine, Scotland. Доктор P. Мэйес в градиенте тартрата калия успешно выделил вирус из культуральной среды инфицированных клеток почки кошек Crandell-Rees.


1.6.4 Вирус кошачьего сомика

Данный вирус имеет ограниченный круг хозяев и лучше всего размножается в клетках американского сомика-кошки. Методы культивирования и очистки этого вируса такие же, как и для ВПГ-1, за исключением того, что ВВ-клетки и вирус культивируют при 28°С.


2. Цитомегаловирус человека

Р-субгруппа герпесвирусов включает в себя цитомегаловирусы различных животных. Цитомегаловирусы человека вызывают различные заболевания, особенно у людей с ослабленной иммунной системой, а также в период беременности. Инфекция этими вирусами довольно часто приводит к смертельному исходу либо вызывает сильнейшее истощение больных с естественной или искусственной иммунной супрессией. Во время беременности этот вирус может вызвать уродства плода, выкидыши и повышенную чувствительность новорожденных к тяжелым инфекциям после родов. Именно по этим причинам в последние 10 лет резко возросла интенсивность изучения цитомегаловируса. Тем не менее, в этой области в отличие от вирусов простого герпеса не достигнуто значительного прогресса.

2.1 Получение заготовок вируса

Репликативный цикл цитомегаловируса человека продолжительнее, чем штаммов ВПГ. Кроме того, данный вирус прочно ассоциирован с клеткой и имеет высокую клеточную специфичность. Хотя во многих лабораториях для наращивания этого вируса используют клетки MRC-5, Flow 5000 или Нер-2, В. Гибсон рекомендует ранние пассажи на фибробластах крайней плоти человека или клетках легкого эмбриона человека. Гибсон культивирует перечисленные клетки в среде DMEM, содержащей 4500 мг/л глюкозы и 10% ЭТС. В нашей лаборатории используют клетки MRC-5, культивируемые в среде Игла в модификации Glasgow с 10% ЭТС. Заготовки вируса получают следующим образом:

1. Не дожидаясь образования плотного монослоя, добавляют CMV в минимальном объеме среды. Адсорбцию вируса проводят 1–2 ч при 37°С.

2. После адсорбции к клеткам добавляют необходимый объем культуральной среды и инкубируют их при 37°С.

3. Через 7–10 дней после заражения старую культуральную среду заменяют на свежую. Клетки продолжают инкубировать при 37°С до выявления признаков ЦПД.

4. Культуры ежедневно просматривают. Когда ЦПД достигнет своего максимума, клетки собирают в культуральную среду и центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин. Собирают супернатант.

5. Осадок ресуспендируют в небольшом объеме культуральной среды, разрушают в ультразвуковой бане и хранят при –70°С.

6. Большая часть вируса содержится в культуральной среде, поэтому супернатант, полученный на стадии 4, центрифугируют 2 ч при 12000 об/мин в роторе GSA.

7. Полученный осадок ресуспендируют в небольшом объеме культуральной среды, осторожно разрушают в ультразвуковой бане и хранят при –70°С. Данный вирус не так стабилен при –70°С, как ВПГ. Поэтому его не следует подвергать частым замораживаниям и оттаиваниям. Оттаивание CMV, как и ВПГ, следует проводить быстро в теплой воде.

2.2 Цикл размножения

Смит и Де Харвен сравнили кривые роста ВПГ и CMV и определили время наступления тех или иных фаз инфекции. Результаты этих исследований приведены на рис. 8 и в табл. 2. Однако остается непонятным, насколько точно отражают данные кривые последовательность событий в зараженной клетке. Как уже отмечалось выше, цикл размножения CMV значительно длиннее, чем ВПГ.

Таблица 2. Время наступления основных этапов инфекции CMV и ВПГ. Сравнительные данные, полученные при помощи электронной микроскопии

Этапы Начало события
CMV ВПГ
Слияние клеток и округление 0,5 6
Изменения аппарата Гольджи 1 8
Скрытый период 2 2
Появление большого количества гранул, напоминающих перихроматин 2 3
Конденсация хроматина Не наблюдается 3
Сборка в ядрах первых капсидов 3 4
Появление первых капсидов, имею- 3,5 5
щих плотную сердцевину
"Одевание" ядерной мембраной 3,5 6
Появление "голых" капсидов в цито- 4 6
плазме
Появление плотных цитоплазматиче-ских агрегатов 4 Не наблюдается
Первые высвободившиеся из клетки частицы 4 8
Удвоение ядерной мембраны 4 8
"Одевание" цитоплазматической мембраной 4 8
Лизис клетки 7–8 24–48

2.3 Идентификация вируса

Множество попыток было предпринято для разработки удобных методов титрования медленно растущих вирусов. В большинстве лабораторий остановились на методе определения конечной точки TCID50. Сложность данной проблемы заключается в сохранении клеточного монослоя в течение времени, необходимого для формирования бляшек. В нашей лаборатории используют следующую модификацию метода бляшек, рекомендованную Вентвесом и Френчем:

1. Клетки линии MRC-5 высевают в 24-луночные планшеты или в чашки Петри диаметром 30 мм для культивирования клеток. Культуры, достигшие состояния монослоя, инфицируют вирусом, разведенным в 200 мкл культуральной среды.

2. По истечении первого часа адсорбции среду заменяют на 1%-ную агарозу, приготовленную на культуральной среде с 2% ЭТС. Клетки инкубируют при 37°С.

3. Через неделю еще раз добавляют необходимое количество агарозы и продолжают инкубацию при 37°С.

4. Через 2–3 нед с момента заражения под микроскопом удается обнаружить небольшие очаги инфицированных клеток. Незадолго до того, как разрушится монослой неинфицированных клеток, культуры фиксируют в забуференном формалине, осторожно удаляют агарозу и окрашивают 1%-ным генцианвиолетом. Небольшие очаги инфекции можно подсчитать под стереомикроскопом. Вместо генцианвиолета культуры можно окрашивать 1%-ным нейтральным красным. Кроме того, нам удалось получить бляшки CMV, используя КМЦ вместо агарозы.

2.4 Метод черных бляшек