Для исследования структуры веществ и изучения химических превращений используется спектроскопия. При исследовании биологических объектов преимущество спектральных методов состоит в том, что вещество в процессе исследования не разрушается. Эти методы позволяют обнаружить незначительные количества веществ.
Оптические методы количественного анализа позволяют регистрировать изменения, происходящие с лучом света при прохождении его через исследуемый раствор, а также измерение излучения молекул исследуемого вещества.
Спектр – это зависимость количества поглощенной или излученной системой энергии от длины волны или другого параметра (например, волнового числа).
Спектр поглощения является специфической характеристикой различных соединений при прохождении через них световой энергии. Спектр может быть получен в видимой ( 400-800 нм), ультрафиолетовой (200-400 нм) или инфракрасной области (800нм-5 мкм). Отдельные пики в спектре соответствуют длинам световых волн, которые поглощаются этим соединением, причем самый большой пик соответствует длине волны с максимальным поглощением.
Молекулы взаимодействуют с излучением в широком диапазоне длин волн и поэтому их спектры лежат в различных областях. Электронные спектры обусловлены переходом электронов наружных оболочек атомов с одного энергетического уровня на другой.
Спектроскопия в видимой и ультрафиолетовой областях. Принцип – энергетический переход внешних электронов в молекулах. Применяется при количественных определениях ферментов и кинетических исследованиях.
Спектрофлуориметрия. Принцип – испускание света, длина волны которого больше чем длина волны поглощенного света. . Применение – количественный анализ, кинетика, качественный анализ.
Инфракрасная спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния. Принцип – колебания атомов в молекуле приводят к изменению дипольного момента и поляризуемости. Применение – качественный анализ.
Пламенная спектрофотометрия. Принцип – энергетические переходы внешних электронов атомов после испарения вещества в пламени.
ЯМР-спектрометрия. Принцип - регистрация магнитных моментов ядер с нечетным числом протонов.
Масс-спектрометрия. Принцип – определение количества положительно ионизированных молекул и их фрагментов. Используется для определения аминокислот в белках.
При исследованиях и клинических анализах бывает необходимость определить очень малые количества соединений в сложных смесях. В этих случаях применяют методы радиоиммунного и ферментиммунного анализа. Эти методы обеспечивают высокую специфичность и чувствительность.
Для проведения радиоиммунного анализа необходимо иметь радиоактивное соединение и смесь g-глобулинов, содержащую антитела к этому соединению, которые специфически связывают его. Чувствительность метода обеспечивается радиоактивностью, а специфичность – использованием антител.
Ферментиммунный анализ основан на конкурентном связывании идентичных лигандов и антитела. В этом методе чувствительность детекции достигается путем использования не радиоактивности, как в радиоиммунном анализе, а ферментов. Специфичность же обусловлена использованием антитела.
Пример - сатурационный анализ. Конкурентное взаимодействие молекул гормона и специфического антитела или другого связывающего белка. Введение меченого лиганда (гормон), маркированного радиоактивным изотопом или коньюгированного (связанного) с каким-либо ферментом, приводит к насыщению (сатурации) связывающего белка. Добавленный к системе немеченный гормон вытесняет часть молекул лиганда из комплекса с белком.
Метод изотопов - принцип его заключается в том, что синтезируется вещество, в молекулы которого вводят атомы радиоактивных или тяжелых изотопов и далее используют для проведения клинических анализов.
Радиоактивные изотопы представляют собой нестабильные формы элементов, способные самопроизвольно распадаться, переходя в более устойчивые формы. Распад сопровождается испусканием альфа, бета или гамма излучения или их сочетанием. В биохимии широко применяются следующие радиоизотопы: углерод-14, водород-3 (тритий), сера-35, фосфор-32 и 33. Эти элементы испускают только бета-излучение. Обнаружить и измерять радиоактивность можно разными способами, используя счетчик Гейгера-Мюллера, жидкостной или твердотельный стинтилляционные счетчики и радиоавтографию.
Ко всем методам, используемым в биохимии, предъявляются определенные требования: они должны обладать точностью, воспроизводимостью, чувствительностью и специфичностью.
Точность отражает степень приближения результата анализа к истинному содержанию определяемого вещества. Представление о точности применяемого метода получают опытным путем. В анализируемый материал (кровь, моча, ткань) вводят известное количество исследуемого препарата и проводят определение.
Воспроизводимость результатов достигается проведением повторных анализов одного и того же образца биологического материала или параллельные определения в серии экспериментов (не менее 20 различных образцов). После этого вычисляют величину стандартного отклонения полученных результатов повторных исследований от среднего содержания.
Под чувствительностью метода подразумевается наименьшее количество определяемого вещества, которое может быть установлено с достаточной достоверностью. Чувствительность метода можно увеличить изменением условий измерения, например, использованием микрокювет в спектрофотометрах и флюориметрах, а также применением более совершенных измерительных приборов. От чувствительности метода зависит и воспроизводимость результатов.
Специфичность – это измерение какого-либо вещества в отличие от других веществ, присутствующих в исследуемом материале. Для обеспечения специфичности химических методов необходимо качественное выделение исследуемого материала, применение характерных для него химических реакций, качество и чистота используемых реактивов, использование совершенных приборов.
Основное требование к методам исследований – это адекватность их к поставленной задаче.
Для оценки полученных результатов используют биометрию – совокупность математических методов, применяемых в биологии и заимствованных из области математической статистики и теории вероятностей. Современная биометрия – раздел биологии, который включает планирование наблюдений и статистическую обработку материала (результатов).
В чем заключаются причины варьирования результатов наблюдений? Биологические признаки могут варьировать под влиянием самых различных причин. Варьирование результатов происходит вследствие:
1) естественной изменчивости признаков, 2) ошибки измерений
Точность измерений:
Обычно измерения проводят с точностью до десятых, сотых или тысячных долей единицы, затем цифры округляют. Полученные данные группируют - объединяют в относительно однородные группы.
Погрешность или ошибка – это разница между результатами измерений и действительно существующими значениями результата измеряемой величины. Ошибки могут возникать из-за неисправности и неточности измерительных приборов и инструментов (технические ошибки), личных качеств исследователя, его навыков и мастерства в работе (личные) и целого ряда других причин (случайные). Технические и личные ошибки являются систематическими, неслучайными, их можно преодолеть, совершенствуя технические средства, условия работы и личный опыт.
Случайные ошибки – это ошибки одиночного значения. Наличие случайных ошибок выражается в том, что при повторном определении одного и того же материала получают не одинаковые, а различающиеся между собой результаты. Величина случайных ошибок является мерой воспроизводимости лабораторных показателей. Чем меньше случайных ошибок, тем лучше вопроизводимость данных. Полученные данные группируют и объединяют в относительно однородные группы, составляя статистические таблицы, статистические ряды – ряд числовых значений признака, расположенных в определенном порядке. Вариационный ряд или ряд распределения – это двойной ряд чисел, показывающий, каким образом числовые значения признака связаны с их повторяемостью в данной статистической совокупности.
Средние величины в отличие от индивидуальных числовых характеристик обладают большей способностью характеризовать целую группу однородных единиц одним средним числом. Среднее арифметическое – это центр распределения, вокруг которого группируются все варианты статистической совокупности.
Результаты биохимических исследований выражаются в единицах СИ. Основные единицы системы СИ – метр, килограмм, секунда, моль. Содержание вещества, молекулярная масса которых известна, выражается величиной молярной концентрации. Молярная концентрация – это количество молей вещества, находящихся в литре раствора. Для выражения активности ферментов применяется размерность моль/секунда/литр.
Расчет концентрации раствора:
массовая концентрация, это количество вещества: г/л , мг/л, мкг/л
молярная концентрация, это количество молей вещества в литре раствора: моль = м.в. /1 л , М/л, мМ/л = 0,1 М, мкМ/л =0,001 М.
Пример : Для приготовления раствора какой-либо концентрации необходимо рассчитать по формуле вещества его молекулярный вес (таблица Менделеева) и это количество вещества растворить в 1 раствора. Если необходимо приготовить раствор меньшего или большего объемов составляют пропорцию: молекул. вес вещества - 1000 мл