Виросла в нерухомому шарі при поверхневому культивуванні культура представляє корж із набряклих часток середовища, щільно пов'язаних зрослися міцелієм. Масу роздрібнюють до гранул 5-5 мм.
Виділення та очищення: процес очищення починається з водної екстракції при 20-25 ° С з відбором 20-22% розчину; середня концентрація СВ в екстрактах - 11-14%. Екстракт може бути використаний для отримання очищених препаратів шляхом осадження ферментів органічними розчинниками або солями. Амілази випадають в осад майже повністю (93-96%) при концентрації етанолу в розчині 69-72%, ацетону - 60-62 і ізопропанол - 54-55%. Як правило, екстраген - вода. При цьому в розчин переходять цукру, продукти гідролізу пектинових речовин і целюлози. Стадію виділення і очищення завершує сушка.
Сушка: культуру висушують до 10-12% вологості при температурах не вище 40 º С, не довше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді - у шкіряній та спиртової промисловості. У харчовій і особливо медичної промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.
Стандартизація: стандартизація ферментного препарату - доведення активності ферменту до стандартної, що відповідає вимогам ГОСТ. Для цього використовуються різні нейтральні наповнювачі - крохмаль, лактоза та ін [2, 30].
7. МЕТОДИКИ ВИЗНАЧЕННЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЇ АКТИВНОСТІ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ
Як правило, ферменти присутні в біологічних об'єктах в мізерно малих концентраціях, тому більший інтерес представляє не кількісний вміст ферментів, а їх активність по швидкості ферментативної реакції (по убутку субстрату або накопичення продуктів).
Для визначення ферментативної активності ферментів застосовуються такі методи, які дозволяють безперервно стежити за ходом перетворення у часі: спектрофотометричні методи, потенціометричні, полярографічні і т.п. Для вимірювання швидкості ферментативної реакції необхідно вибрати буфер, який не гальмує досліджувану активність і забезпечує підтримку рН розчину, близької до оптимальної для даного ферменту. Реакцію проводять при температурі, що лежить в більшості випадків в межах 25-40 º С. При дослідженні ферментів, що вимагають присутності кофакторів (іонів металів, коферментів та ін), концентрація яких може знижуватися в міру очищення ферменту, в реакційну суміш слід додавати відсутні кофактори, наприклад солі металів, АТФ, НАДФ і т.п. Також для визначення активності ферментів вводять стабілізатори до складу досвідчених сумішей[31].
7.1 Спектрофлюрометричні методи
Для цілей визначення ферментів можуть бути використані не тільки вимірювання поглинання світла, але також вимірювання флуоресценції – спектрофлюрометричні методи. Таке визначення активності ферменту в ряді випадків по чутливості перевершує спектрофотометричні методи на цілий порядок величини. Деякі коферменти і субстрати мають сильну флуоресценції. НАД та НАДФ у відновленому стані мають сильну флуоресценцію і не флуорисцують в окисленому стані[31, 33].
7.2 Колориметричні (фотометричні) методи
В основі цих методів лежить вимірювання за допомогою візуального або фотоелектричного колориметр пофарбованого продукту, що утворюється при взаємодії субстрату або продукту дії ферменту зі специфічними реактивами, які зазвичай додаються в фіксовану дослідну пробу, взяту після зупинки ферментативної реакції. Ці методи дуже різноманітні. Розроблені кількісні методи, засновані на біуретової реакції, при якій склад білку, очевидно не повинен позначатися на результатах визначення, тому що ця реакція на пептидні зв'язки, а не на бічні групи в білку. Метод Горнелла і співавторів, заснований на вимірюванні смуги поглинання в області 550-650 нм, використовується для визначення значних кількостей (1-10 мг) білка в пробі. Пропонуються біуретовим мікрометодом, засновані на поглинанні ультрафіолетових променів мідно-білковими комплексами: вони дозволяють визначати 0.1 - 2.0 мг білка в пробі. Число небілкових речовин, які можуть впливати на визначення за допомогою біуретової реакції, невелика, але слід вносити поправки на ті речовини, які присутні у високих концентраціях (солі амонію, сахароза). Найбільш цінними є ті фотометричні методи, які дозволяють стежити в часі за ходом ферментативної реакції без її припинення щодо зміни забарвлення хромогенного субстрату або доданого індикатора. Метод Толіна і Чіокальто, запропонований для визначення кількості білка, заснований на хромогенних природі деяких бокових груп амінокислот, а також на присутності в білках пептидних зв'язків. Цей метод має високу чутливість (на пробу досить 0.01 - 0.1 мг білка), але багато небілкових речовини заважають визначенням.
В даний час для визначення кількості білка широко користуються вимірюваннями інтенсивності поглинання світла при 280 нм, що обумовлено присутністю в білку ароматичних амінокислот. Кількість цих амінокислот у різних білках по-різному і, отже, інтенсивність неоднакова. У кюветі товщиною 1 см у розчину, який містить 1 мг "усередненого" білка в 1 мл, оптична щільність дорівнює 1 при довжині хвилі 280 нм. Нуклеїнові кислоти поглинають при 280 нм, але можна зробити поправку на їх присутність, проводячи вимірювання і при 260 нм і при 280 нм. Дуже важлива швидкість вимірювання активності ферментів. Те ж відноситься і до вимірювання кількості сухого залишку або кількості білка. Тим самим віддають перевагу швидкому метод визначення білка шляхом вимірювання величини поглинання при 280 нм. Виграний час важливіше, за рахунок того, що питоме поглинання виділяється білка іноді значно відрізняється від середньої величини поглинання суміші білків, присутніх у вихідному матеріалі[32, 33].
7.3 Спектрофотометричні методи
Спектрофотометричні методи засновані на поглинанні світла в певних ділянках спектру багатьма сполуками, які є активними групами ферментів, субстратами або продуктами реакції. Положення максимуму поглинання при певній довжині хвилі визначається наявністю в досліджуваному матеріалі певних груп - аналітичних форм. Для вимірювання спектрів використовують спеціальні прилади - спектрофотометри, фотометричні абсорбціометри та ін Цей метод відрізняється високою чутливістю, швидкістю визначення, малим витрачанням ферменту і реактивів і дозволяє стежити за перебігом реакції у часі. Для цього реакційну суміш поміщають в кювету, вставлену в термостатуємий кюветотримач. Через малий проміжок часу після додавання ферменту (або субстрату) і швидкого перемішування вимірюють поглинання при довжині хвилі, характерної для використовуваного субстрату або кінцевого продукту, що утворюється в даній реакції. За допомогою спектрофотометричних методу можна вимірювати безпосередньо концентрацію деяких ферментів (після достатньої очищення) за величиною характерних максимумів поглинання міцно пов'язаних коферментів (простетичних груп). Необхідно мати довільно вибрану одиницю ферменту, за допомогою якої можна було б кількісно виразити чистоту і активність різних фракцій. У більшості випадків вибір одиниці залежить від обраного методу визначення. У разі спектрофотометричних методу такою одиницею може служити кількість ферменту, що викликає певну зміну в оптичної щільності за певний час за даних умов досвіду; якщо визначається продукт реакції, то одиницею буде кількість ферменту, що викликає утворення певної кількості речовини в хвилину, і т.д . Тоді питому активність ферменту, яка є мірилом чистоти ферментного препарату, виражають числом одиниць в 1 мг речовини (білка)[32, 33].
7.4 Манометричні методи і інші методи
Ці методи використовуються при визначенні активності ферменту в тих випадках, коли в досліджуваних реакціях один з компонентів знаходиться в газоподібному стані. До таких реакцій відноситься головним чином ті, що пов'язані з процесами окислення і декарбоксилювання, що супроводжуються поглинанням або виділенням кисню і вуглекислоти, а також реакції, в яких виділення або зв'язування газу відбувається в результаті взаємодії продуктів ферментативного перетворення з доданим до системи реактивом. Спостереження за ходом реакції у часі проводиться в спеціальних приладах – манометричних апаратах Варбурга.
Інші методи: сюди відноситься великий ряд методів, що включають поляриметрії, віскозиметрі, потенції-і кондуктометричні вимірювання і т.п. Також визначення активності можна виконувати, використовуючи методи хроматографії та електрофорезу на папері. Ці методи високочутливі і специфічні, що робить їх у багатьох випадках незамінними; вони дозволяють значно скоротити витрату ферменту на вимірювання активності, але не завжди застосовні через тривалості розділення речовин у процесі хроматографії (та електрофорезу) [32, 33].
ВИСНОВОК
З вище сказаного стає зрозумілим, що важливою ланкою на біотехнологічному ринку було є та буде виробництво ферментних препаратів. По даним досліджень об’єм російського та українського ринків ферментних препаратів на сьогоднішній день складає приблизно 50 млн доларів США. Здебільшого спрямування ринку йде на задоволення потреб спиртової галузі виробництв та кормового виробництва. Але також набирає обертів і потреба у ферментах в медичній та інших промисловостях. З кожним роком розвиток ринку досягається шляхом збільшення ефективності продукованих ферментів, розробка нових, більш дешевих методів виробництва, пошуку нових галузей використання готового продукту.
У науково-дослідних організаціях постійно проводиться робота з поліпшення ефективності виробництва ферментних препаратів, в основному по підвищенню активності, зрілої культури. Це досягається не тільки селекцією штамів мікроорганізмів, але і вдосконаленням умов культивування, в тому числі і зміною складу живильного середовища.