Выпавший осадок лактоглобулина отделяли от раствора путем фильтрации через воронку Бюхнера с двойным слоем хроматографической бумаги.
Плотный осадок переносили в целлофановые мешочки и подвергали диализу в проточной водопроводной воде, а затем в дистиллированной воде до тех пор, пока в растворе не обнаруживалось даже следов сернокислого аммония, что проверяли реактивом Несслера.
По окончании диализа определяли концентрацию белка (рефрактометрически) в растворе лактоглобулина и дистиллированной воды разбавляли его до содержания 10 % белка. К раствору добавляли хлорид натрия до изотонического насыщения.
Подученный препарат подвергали стерилизующей фильтрации через фильтр Зейтца с пластинкой СФ и расфасовывали по ампулам и флаконам.
Стерильность полученного препарата подтверждали высевом на МПБ, МПА и среду Китт-Тарроци, а безвредность на белых мышах и морских свинках. Посевы выдерживали в термостате при 37° С восемь суток. Лактоглобулин вводили подкожно двум морским свинкам массой 230-240 г в дозе по 3 мл и четырем белым мышам массой 16-18 г по 0,5 мл с последующим наблюдением за животными в течение 5 дней.
Исключение примесей балластных белков в препарате производили электрофоретически. Препарат хранили в холодильнике при температуре +3 +5° С.
Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови телят до приема молозива и через 24 ч после рождения определяли цинк-сульфатным методом [A. D. MсEwan, E. W. Fisher, I. E. Selman and W. J. Penhale, 1970].
Концентрацию иммуноглобулинов молозива коров с учетом их возраста вычисляли по уровням линейной регрессии [H. Balbierz, M. Nicolaijczuk, J. Zeilinski, 1983].
Эффективность колостральных иммуноглобулинов изучали по отношению содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови неонатальных телят к количеству поступивших с молозивом.
Количественную характеристику абсорбции колостральных иммуноглобулинов классов G, М и А устанавливали методом радиальной иммунодиффузии [G. Mancini, A. O. Carbonara and J.F. Heremans, 1965; В. М. Чекишев, 1977]. Выделенные иммуноглобулины классов G, М и А служили антигенами для иммунизации кроликов [R. A. Wilson and I. W. Jutila, 1976] с целью получения соответствующих моноспецифических антисывороток.
Степень катаболизма иммуноглобулинов изучали определением их классов в сыворотке крови методом радиальной диффузии. Иммуноглобулины в фекалиях определяли по E. F. Logan, W. J. Penhale, 1972; Р. П. Маслянко, 1982.
После измерения диаметров зон преципитации концентрацию иммуноглобулинов рассчитывали математическим способом, исходя из прямо пропорциональной зависимости между ней и квадратом диаметра кольца [Э. Бем, 1979].
Колостральную сыворотку отделяли после добавления сычужного фермента. Лактоглобулин получали добавлением к сыворотке молозива насыщенного раствора сульфата аммония с последующим диализом против 0,01М рН 7,6 Na2HPO4; KН2PO4.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием критерия достоверности Стьюдента.
| Группы телят | Средняя арифметическая, мг/мл | Дисперсия | Среднее квадратическое отклонение | Средняя арифметическая ошибка | Точность прямых измерений | Доверительный интервал, мг/мл | Относительная ошибка (погрешность), % |
| До приема молозива | 0,18 | 0,0035 | 0,019 | 0,008 | 0,02 | 0,16-0,20 | 11,1 |
| Через 24 ч после рождения: I группа — контроль | 23,94 | 14,69 | 3,83 | 1,71 | 4,75 | 18,19-28,69 | 19,8 |
| II группа — энтеритная форма колибактериоза | 18,26 | 0,16 | 0,4 | 0,18 | 0,49 | 17,77-18,75 | 2,68 |
| III группа — септическая форма колибактериоза | 15,37 | 0,66 | 0,43 | 0,19 | 0,53 | 14,84-15,90 | 1,24 |
Новорожденные телята с содержанием иммуноглобулинов 23,94± 1,71 мг/мл (доверительный интервал 19,19-28,69 мг/мл) переболели легкой формой колибактериоза на третьи сутки. Даже такая высокая концентрация иммуноглобулинов не обеспечивала иммунологический статус новорожденных телят, что связано со значительной инфицированностью внешней среды и снижением вследствие этого защитного уровня молозива.
Содержание иммуноглобулинов через 24 часа в сыворотке крови телят сильно варьирует и составляет от 19,85 мг/мл до 29,11 мг/мл. Такая разница объясняется количеством проглоченного теленком молозива.
Способность новорожденных животных адаптироваться к изменениям внешней среды лимитировано и изменение условий, не влияющих на взрослых животных, может плохо отразиться на состояние здоровья телят. Известно, что стресс является способствующим фактором возникновения колибактериоза у телят. Причиной стресса могут быть различные нарушения условий содержания, порой самые безобидные, поэтому предотвратить стресс весьма трудно. Даже перемещение является причиной стресса, который приводит к увеличению уровня заражения инфекционными агентами. Низкая температура, сквозняки, влажная подстилка способствуют возникновению и распространению инфекции. Следовательно, иммунологический статус, необходимый для защиты организма, зависит от количества молозива, проглоченного теленком в первые минуты жизни и условий внешней среды.
Исходя из этого, невозможно точно указать количество колостральных иммуноглобулинов, обеспечивающих иммунологическую защиту животных.
При концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови телят 18,26±0,18 мг/мл (доверительный интервал 17,77-18,75 мг/мл) заболевание протекает с расстройством пищеварения,и сопровождается средней тяжестью дегидратации а также диареей. Такие телята отказываются от молозива, с трудом поднимаются, задняя часть туловища испачкана фекалиями, влажная.
Длительность течения болезни при такой концентрации иммуноглобулинов обычно составляет 4-6 дней. Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови телят с энтеритной формой колибактериоза ниже, чем в контрольной группе (Р<0,05).
В сыворотке крови телят III группы концентрация иммуноглобулинов была самой низкой и составляла 15,37±0,19 мг/мл при доверительном интервале 14,82-15,90 мг/мл. По сравнению с контрольной группой изменения в содержании иммуноглобулинов статистически достоверны (Р<0,01). У животных отмечалась септическая форма колибактериоза, депрессия, дегидратация. Течение болезни проявляется профузным поносом, усиленной перистальтикой кишечника, глаза запавшие, телята не способны были стоять на ногах и погибали в 7-10 дневном возрасте. Существенное уменьшение концентрации иммунных глобулинов в данной группе животных ассоциировалось с тяжелой степенью дегидратации и выраженной диареей.
Коэффициент вариации в исследуемых сыворотках колебался от 2,29 % во 2-й опытной группе до 15,9 % в контрольной.
При бактериологическом исследовании ректальных тампонов и патологического материала выделили вирулентные штаммы Е. coli. Пробы брали до лечения в течение 12 часов с начала диареи.
Исходя из результатов исследований, рекомендуем при содержании иммуноглобулинов в сыворотке крови телят суточного возраста 18,26±0,18 мг/мл задавать взамен молока дважды в день 2 л изотонического раствора глюкозы, хлорида натрия и антибактериальные препараты. При концентрации иммуноглобулинов 15,37±0,19 мг/мл, парентерально вводить кровь, сыворотку крови, сыворотку молозива (внутривенно) и антибактериальные препараты. Применение антибиотиков и изотонических растворов глюкозы и хлорида натрия при септической форме колибактериоза не является эффективным, так как выживание телят в таких случаях зависит от высокой концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови.
Всасывание иммуноглобулинов происходит в кишечнике, и через лимфатические пути они попадают в кровь. Иммуноглобулины появляются в лимфе уже через 1-2 ч после поступления их в двенадцатиперстную кишку животных. Факторы, обеспечивающие всасывание нерасщепленных молекул белка, как и причины, по которым впоследствии оно становится невозможным, до настоящего времени изучены недостаточно. J.W.Boyd (1972) указывает на существование специальных внутриклеточных рецепторов узнавания, обеспечивающих селективную передачу белков в кровь. Исследование механизмов транспорта и катаболизма иммуноглобулинов in vitro показало, что на первых этапах всасывания формируется комплекс между иммуноглобулинами и специфическими рецепторами энтероцитов. Во взаимодействии с рецепторами клеток кишечника участвует Fc — фрагмент иммуноглобулинов. По-видимому, связывание иммуноглобулинов с клетками предохраняет их от катаболизма и способствует транспорту в кровь [И. И. Головистиков, 1979].