2.2.8.1. Серологический тест.Для разрушения комплементной активности сыворотку инактивировали при 56° С в течение 30 мин. Все сыворотки в том числе молозивные и молочные, абсорбировали с эритроцитами барана, исключая какие-либо антитела к эритроцитам. Агглютинирующие антитела определяли по методу Е. Neter (1957), за исключением того, что эритроциты барана были утилизированы и был приготовлен антиген высушенный ацетоном.
Антиглобулиновый тест применяли для определения неагглютинирующих антител [E. Neter, 1957], применяя антиглобулиновую (бычью) сыворотку. Все титрации проводили в двукратном разведении ранг серии от 2-2 до 2-11, применяя 0,1 мл разведенной сыворотки и 0,1 мл 2 % суспензии антигена с эритроцитами барана, которые были промыты 3 раза после антигенной абсорбции.
Агглютинационный тест учитывали после 90-120 минутной инкубации при комнатной температуре.
Антиглобулиновый тест определяли после 1 ч инкубации в термостате при 37° С и 12 ч экспозиции в холодильнике при 4° С.
Предельное сывороточное разведение, которое имело хорошо выраженную агглютинацию, учитывали как титр этой сыворотки. Чувствительность антител к 2-меркаптоэтанолу определяли инкубацией сыворотки в 0,1М растворе CH2SH-CH2OH при 37° С в течение 30 мин. Резистентность к этой обработке была взята как показание, что антитела не являются макроглобулинами.
2.2.8.2. Абсорбционный тест. Определение специфичности антител абсорбционным методом было проведено с сывороткой молозива и крови телят. Сывороточные образцы получали от телят через 12-24 ч после кормления молозивом и были разделены по уровню антител против трех антигенов. Сыворотку молозива и сыворотку крови телят абсорбировали с каждым из трех серотипов у Е. coli. Три серотипа Е. coliинкубировали в колбе-матраце на МПА.
Микроорганизмы смывали из агара барбиталовым (вероналовым) буфером и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 30 мин.
Затем бактерии прибавляли к сыворотке крови телят и молозивной сыворотке из расчета 2×1011 бактерий на 1 мл. Абсорбцию проводили при 37° С в течение 60 мин и суспензию центрифугировали при 12000 об/мин 30 мин. Супернатант сыворотки телят и молозивной сыворотки удаляли из массы клеток, а осадок хранили при -20° С до тестирования.
2.2.8.3. Уровень антител против К-антигенов в сыворотках молозива и молока.Средний титр антител в молозивной сыворотке против К антигенов из 3 штаммов Е. coliпредставлен в табл. 2.19. Агглютинирующиеся антитела выявляются менее часто, чем антиглобулиновые антитела в тестированных образцах молозива. Положительный тест — результат установлен соответственно в 53,83 % (антиген О78:К80) и 88,24 % (антиген О137:К79) случаев. Средний титр антител в аналогичных условиях равнялся 4,63±0,73 и 6,87±0,56.
| Антиген | Тест | Количество проб | Образцы с положительным результатом, % | Средний титр |
| О78:К80 | Агглютинационный | 15 | 53,33 | 4,63±0,73 |
| Антиглобулиновый | 15 | 80,00 | 5,92±0,67 | |
| О119:К69 | Агглютинационный | 14 | 71,43 | 5,6±0,70 |
| Антиглобулиновый | 13 | 92,31 | 6,42±0,67 | |
| О137:К79 | Агглютинационный | 16 | 75,00 | 6,25±0,69 |
| Антиглобулиновый | 17 | 88,24 | 6,87±0,56 |
Из 69 исследованных проб сывороток молозива агглютининовым и антиглобулиновым тестами 9 проб имели антитела, обнаруживаемые только антиглобулиновым методом. Средний титр антител был существенно выше при тестировании антиглобулиновым методом по сравнению с агглютинационным, тем не менее, в 4 образцах получены совпадающие результаты, а в одном случае титр агглютининов был выше на одно разведение. Средний титр был вычислен только из тест положительных образцов. Высокий титр антител был установлен агглютинационным и антиглобулиновым методами против К антигена серотипа О137:К79 (6,25±0,69 и 6,87±0,56).
Результаты исследования образцов молока, полученного от коров на различных стадиях лактации, показаны в табл. 2.20. Антитела против Е. coliК-антигена были обнаружены в молоке агглютинационным и антиглобулиновым методами, но частота и уровень активности антител были намного меньшими, чем в молозиве.
| Антиген | Тест | Количество проб | Образцы с положительным результатом, % | Средний титр |
| О78:К80 | Агглютинационный | 15 | 21,43 | 3,33±0,58 |
| Антиглобулиновый | 15 | 42,87 | 3,17±0,41 | |
| О119:К69 | Агглютинационный | 14 | (3) 23,08 | 2,67±0,58 |
| Антиглобулиновый | 13 | (8) 66,67 | 3,63±0,75 | |
| О137:К79 | Агглютинационный | 16 | (6) 46,15 | 3,17±0,41 |
| Антиглобулиновый | 17 | (11) 84,62 | 4,36±0,92 |
Двенадцать из 37 проб (тест положительных) сывороток молока имели антитела против 3 тестированных антигенов. Причем 12 проб были тест положительными при исследовании как агглютинационным, так и антиглобулиновым тестами, 27 тест положительных проб выявляли только антиглобулиновым методом. Из 14 проб сывороток молока выявляли антитела против К антигена Е. coliштамм О78:К80 в трех совпадающих пробах агглютинационным и антиглобулиновым методом. Антитела к К антигену Е. coliштамм О119:К69 выявлены тестированными методами из 13 проб в 3 случаях и дополнительно в 5 случаях только антиглобулиновым методом. Антитела к К антигену Е. coliштамм О137:К79 выявляли в 6 совпадающих случаях обеими методами и дополнительно в 5 пробах только антиглобулиновым методом.
2.2.8.4. Уровень антител против К антигена в сыворотке новорожденных телят.Результаты исследования сывороточных проб телят в возрасте от 1 до 5 дней указывает, что большинство телят приобретают после рождения антитела, выявляемые антиглобулиновым, а не агглютинационнымтестом. Сопоставление уровня антител в сыворотке молозива и в сыворотке крови телят через 12-24 ч после кормления молозивом, представлены в табл. 2.21.
| Антиген | Тест | Количество проб | Средний титр в сыворотках | |
| молозива коров | крови телят | |||
| О78:К80 | Агглютинационный | 5 | 4,40±0,54 | 3,20±0,45 |
| Антиглобулиновый | 5 | 6,80±0,87 | 5,80±0,45 | |
| О119:К69 | Агглютинационный | 7 | 5,43±0,53 | 4,14±0,37 |
| Антиглобулиновый | 6 | 7,17±0,41 | 6,17±0,41 | |
| О137:К79 | Агглютинационный | 6 | 5,83±0,41 | 4,83±0,41 |
| Антиглобулиновый | 7 | 7,43±0,53 | 6,71±0,48 | |
В нескольких случаях титр антител в сыворотке крови телят был эквивалентным уровню колостральных антител, но, как правило, титр антител в сыворотке телят был меньшим на 1-2 разведения, чем титр в сыворотке молозива. Телята, лишенные молозива, не содержали антител против К антигена Е. coliтестированных серотипов. Антитела в молозиве и антитела в сыворотке неонатальных телят не инактивировались при обработке 2-меркаптоэтанолом CH2SH‑CH2OH. Средний титр антител в сыворотке крови телят, кормившихся молозивом варьировал в зависимости от тестированных К антигенов Е. coli О78:К80, О119:К69, О137:К79. Существенное различие в уровне антител установлено при их выявлении агглютинационным и антиглобулиновым методами(табл. 2.22).
Уровень антител при исследовании антиглобулиновым методом был на 2-3 разведения большим по сравнению с агглютинационным тестом.
| Антиген | Количество образцов | Положительный тест результат, % | |
| Агглютинационный тест | Антиглобулиновый тест | ||
| О78:К80 | 16 | 31,25 | 33,33 |
| О119:К69 | 16 | 33,33 | 56,26 |
| О137:К79 | 16 | 31,25 | 62,5 |
2.2.8.5. Абсорбция антител против К-антигенов Е. coli из сыворотки молозива и крови телят.Результаты абсорбционного теста колостральных образцов, полученных от коров при первом доении после отела и сывороточных образцов, взятых у телят в течение 1 дня после кормления молозивом представлены в табл. 2.23.
Все исследуемые пробы, абсорбированные антигенами, подавляли активность антител к антигенам Е. coliО78:К80, О115:К69. Антитела против антигена О137:К79 имели наименьшее влияние на абсорбцию по сравнению с другими антигенами. Два серотипа Е. coliО78:К80, О119:К69 имели К антиген В типа, тогда как серотип О137:К79 имел К антиген А типа. Это различие в типах К антигена и имеет значение в перекрестной реакция с серотипом О137:К79.
| Источник антител | Абсорбент | Титр антител | |||||
| О78:К80 | О119:К69 | О137:К79 | |||||
| АГТ* | АНТ | АГТ | АНТ | АГТ | АНТ | ||
| Молозиво №4456 | нет | 0 | (1:32) 5 | 0 | (1:64) 6 | (1:32) 5 | (1:64) 6 |
| О78:К80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| О119:К69 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| О137:К79 | 0 | (1:16) 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Молозиво №3457 | нет | 0 | (1:16) 4 | 0 | (1:32) 5 | (1:64) 6 | (1:16) 4 |
| О78:К80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| О119:К69 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| О137:К79 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Сыворотка телят №4757 (однодневный возраст) | нет | (1:8) 3 | (1:128) 7 | (1:64) 6 | (1:128) 7 | (1:128) 7 | (1:1024) 10 |
| О78:К80 | 0 | 0 | 0 | 0 | (1:64) 6 | (1:128) 7 | |
| О119:К69 | 0 | 0 | 0 | 0 | (1:64) 6 | (1:512) 9 | |
| О137:К79 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Сыворотка телят №4759 (однодневный возраст) | нет | (1:32) 5 | (1:128) 7 | (1:32) 5 | (1:256) 8 | (1:64) 6 | (1:512) 9 |
| О78:К80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| О119:К69 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0(1:64) 6 | 0 | |
| О137:К79 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Сыворотка телят №4767 (однодневный возраст) | нет | 0 | (1:64) 6 | (1:16) 4 | (1:64) 6 | (1:32) 5 | (1:128) 7 |
| О78:К80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | (1:16) 4 | |
| О119:К69 | 0 | 0 | 0 | 0 | (1:16) 4 | (1:64) 6 | |
| О137:К79 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
* Титр, выраженный в log2