Контрольные вопросы.
1. С какой целью выращивают стерильные проростки?
2. Каковы возможные пути использования стерильных проростков?
3. Какие среды используют для выращивания стерильных проростков?
Литература
1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.
3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.
9. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.
10. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.
11. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.
Приложение.
Таблица 1. Среда Уайта, рН 5,6-5,8
| Компоненты | Содержание, мг/л | Компоненты | Содержание, мг/л |
| Ca(NO3)2 | 200 | CuSO4.5H2O | 0,02 |
| MgSO4 | 360 | ZnSO4 | 1,5 |
| Na2SO4 | 200 | Na2MoO4.2H2O | 0,0025 |
| KNO3 | 80 | Kl | 0,75 |
| KCl | 65 | Пиридоксин-HCl | 0,1 |
| NaH2PO4 | 16,5 | Тиамин-HCl | 0,1 |
| H3BO3 | 1,5 | Никотиновая кислота | 0,5 |
| MnSO4 | 4,5 | Глицин | 3,0 |
| Fe(SO4)3 | 2,5 | Сахароза | 20.000 |
Таблица 2. Среда Гамборга (В-5), рН 5,8
| Компоненты | Содержание, мг/л | Компоненты | Содержание, мг/л |
| NaH2PO4.H2O | 150 | ЭДТА-Na2.2H2O | 37,3 |
| KNO3 | 2500 | Na2MoO4.2H20 | 0,25 |
| (NH4)2SO4 | 134 | Kl | 0,75 |
| MgSO4.7H2O | 250 | FeSO4.7H2O | 28,0 |
| CaCl2.2H2O | 150 | Тиамин- HCl | 10,0 |
| H3BO3 | 3,0 | Пиридоксин- HCl | 1,0 |
| MnSO4.7H2O | 10,60 | Никотиновая кислота | 1,0 |
| CoCl2.6H2O | 0,025 | Мезо - инозит | 100 |
| CuSO4.5H2O | 0,025 | 2,4-Д | 2,0 |
| ZnSO4.7H2O | 2,0 | Сахароза | 20.000 |
Лабораторная работа № 4
ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ
АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ КАРТОФЕЛЯ
Цель работы. Выделение апикальных меристем картофеля, их культивирование с целью получения безвирусных растений картофеля.
Теоретическое обоснование. Из апикальных меристем в питательной среде получают безвирусные растения картофеля, которые могут быть размножены и высажены в теплицы для получения безвирусных клубней. Для ускоренного размножения материала используются также клубни, полученные in vitro.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Клубни картофеля. Пробирки со стерильной питательной средой (табл.1).
Бинокулярная лупа, скальпели, препаровальные иглы, лезвия, зажатые в держателе.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Клубни картофеля хранят в течение недели при температуре 4-8оС, затем проращивают в темноте при температуре 20-22оС. Работы по вычленению меристем проводят в ламинар-боксе. Инструменты, используемые для вычленения (пинцеты, скальпели, иглы), стерилизуют перед каждым вычленением, погружая в спирт с последующим обжиганием. От тщательно вымытых клубней отделяют отростки и стерилизуют в 0,1%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут, с последующей трехкратной промывкой стерильной Н2О. Простерилизованные ростки помещают в стерильную чашку Петри и добавляют несколько капель автоклавированной воды для предупреждения их подсыхания. Перед вычленением с верхушки ростка удаляют покровные листочки, последовательно обнажают боковые и верхушечные меристемы с примордиальными листочками. Эту операцию проводят с помощью препаровальной иглы под бинокулярной лупой. Меристему размерами 100-250 мкм без листовых зачатков (примордиев) вычленяют обычной тонкой иглой, зажатой в держатель. Вычленять можно как верхушечную, так и боковые меристемы. Меристему на острие иглы переносят на поверхность питательной среды в пробирку, закрывают ее пробкой над пламенем горелки и ставят в штатив. После заполнения штатив с пробирками закрывают целлофановым колпаком для предупреждения подсыхания сред и ставят в световую камеру. Через две, три, четыре недели наблюдают за развитием из меристемы побега и зарисовывают этапы этого процесса.
Требования к отчету по лабораторной работы
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы.
1. Какие части растения используют для ускоренного размножения?
2. С какой целью из растений вычленяют апикальные меристемы?
3. Какими способами пользуются в работе во избежание подсыхания питательных сред?
Литература
1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.
3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.
12. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.
13. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.
14. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.
Приложение.
Таблица 1. Модифицированная питательная среда Мурасиге
и Скуга для культивирования апикальных меристем картофеля,
рН 5,7-5,8
| Компоненты | Содержание, мг/л | Компоненты | Содержание, мг/л |
| Минеральные элементы | По Мурасиге-Скугу | Гиббереллиновая кислота | 1-10 |
| Сахароза | 20000 | Никотиновая кислота | 2 |
| Глюкоза | 20000 | Фолиевая кислота | 0,5 |
| Гидролизат казеина | 1000 | Кинетин | 0,5 |
| Мезо-инозит | 100 | Пантеонат Са | 10 |
| Тиамин | 1 | Рибофлавин | 0,5 |
| Пиридоксин | 1 | Биотин | 1 |
| Аденин | 40 | Активированный уголь | 10000 |
| Витамин В12 | 0,015 | Агар-агар | 7000 |
Лабораторная работа № 5
МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ КАРТОФЕЛЯ
ЧЕРЕНКОВАНИЕМ ПОБЕГОВ
Цель работы. Черенкование растений в пробирочной культуре с целью получения безвирусных побегов картофеля.
Теоретическое обоснование. Полученные из апикальных меристем на искусственной питательной среде безвирусные растения картофеля размножают. Один из наиболее распространенных способов размножения картофеля состоит в черенковании растений в пробирочной культуре. Растения вынимают из пробирок и разрезают так, чтобы в каждой части находился отрезок стебля с листом и пазушной почкой. Черенки пересаживают в пробирки с питательной средой.
Размножение черенкованием основано на подавлении апикального доминирования и активации пазушных меристем при удалении верхушки побега. Из пазушной почки развивается побег.
Каждое следующее черенкование проводят через 16-20 дней. Из одного растения получают до восьми черенков. За два-три месяца от одного растения черенкованием можно получить три-пять тысяч растений. В культуре in vitro у черенков картофеля можно индуцировать появление клубней, доведя концентрацию сахарозы в среде до 30 мг/л.
Следующий этап размножения оздоровленного посадочного материала проводят в теплице. Растения из пробирок вместе с агаровой питательной средой переносят в горшки с почвой. На третий-седьмой день растения подкармливают раствором Кнопа. Через 10-15 дней растения пересаживают на постоянное место в теплицах для получения клубней.