Протеолитическая активность характеризуется числом единиц активности фермента, содержащегося в 1 г препарата и твердых полупродуктов или в 100 мл жидких материалов. Метод предназначен для анализа очищенных ферментных препаратов грибного происхождения и всех полупродуктов, получающихся при их производстве.
Определение пепсина по Ансону и Мирскому. Данный метод основан на следующих принципах. Гемоглобин подвергают воздействию пепсина, оставшийся гемоглобин осаждают трихлоруксусной кислотой. Фенольные свойства остатка (тирозин), определяемые фотометрически, используют как меру активности фермента.
Субстратом служит 2%-ный раствор гемоглобина в 0.06 н. растворе соляной кислоты, 5 мл субстрата нагревают до 25 0 С, прибавляют 1 мл раствора фермента, оставляют в течении 10 мин., добавляют 10 мл 0.3 н. раствора трихлоруксусной кислоты, энергично взбалтывают, фильтруют и 5 мл фильтрата отливают в мерную колбу на 25 мл. Сюда же приливают 10 мл 0.5 н. раствора едкого натра и 3 мл фенольного реактива (реактив Фолина-Чиокалтеу разводят предварительно двойным объемом воды) и доводят водой до метки. По истечении нескольких минут окрашенный раствор фотометрируют относительно стандартного раствора, содержащего 0.0008 мэкв тирозина в 5 мл 0.2 н. раствора соляной кислоты (к раствору добавляют 0.5% формальдегида в качестве антисептика). Для исключения возможных ошибок ставят холостой опыт. Единицы пепсина выражают в миллиэквивалентах тирозина (в пределах от 6 . 10 -4 до 11 . 10 -4 ): единицы пепсина = миллиэквиваленты тирозина х1.47.
Определение протеолитических ферментов по Муру и Штейну. Метод основан на том, что содержащие a -аминогруппу аминокислоты дают с нингидридом окрашенную производную - дикетогидриндилидендикетогидриндамин, а также альдегид-аминокислоты и углекислоту.
Окрашенный продукт обладает характерным максимумом поглощения при 570 мm , а интенсивность окраски зависит от количества аминокислоты. С пролином и оксипиролином реакция протекает в ином направлении, а максимум поглощения получаемого при этом окрашенного продукта расположен при 440 мm .
Инкубацию фермента удобно проводить в мерных колбочках по 5 мл, в которых смешивают и уравновешивают при постоянной температуре на водяной бане все компоненты за исключением фермента. После этого добавляют фермент, раствор смешивают и берут пробы для исследования. Для кинетических измерений концентрацию фермента желательно подобрать таким образом, чтобы аликвотные части можно было бы брать каждые 5 минут.
Аликвотные части пробы, взятые сразу же после добавления фермента, а затем через соответствующие интервалы, добавляют в фотометрические пробирки, содержащие 2 мл реактива нингидрида - это тотчас обрывает реакцию. После этого смесь 20 мин. нагревают на водяной бане; полученная окраска устойчива минимум 24 часа. Средняя ошибка при анализе повторных проб составляет ± 2%. После разбавления кипяченой смеси пробы и нингидрида 10 мл смеси, состоящей из равных объемов воды и н.пропанола, интенсивность окраски определяют на спектрофотометре Колемана при 570 мm .
Для калибровки пользуются постоянными количествами стандартных аминокислот, содержащих реакционные компоненты. При помощи калибровочных кривых, построенных отдельно для каждой исследуемой аминокислоты, измерения интенсивности окраски (по отношению к контрольной колбе) пересчитывают в миллимоли. При делении этих величин на миллимоли субстрата, использованного в процессе реакции, можно найти процент гидролиза.
Построение калибровочной кривой исключает ошибки, происходящие от качественных различий реакции аминокислот на цветной реактив. До оптической плотности 0.1 зависимость между величиной поглощения и количеством субстрата носит линейный характер.
Воспроизводимость составляет ± 3%. Мешающее влияние аммония, аминов и других веществ, содержащихся в биологическом материале и дающих цветную реакцию с нингидридом, исключается при помощи соответствующих холостых проб. Анализ сравнительно упрощается, когда изучают протеолитические ферменты, субстратами которых являются пептиды, не содержащие свободных аминогрупп. В этом случае вся образующаяся окраска целиком приходится на освободившуюся аминокислоту.
Микрометод определения активности протеиназ А.П.Алексеенко. Предлагаемый микрометод определения активности протеолитических ферментов основан на измерении содержания аргинина в пептидах, освобождающихся при гидролизе протеиназами белковых субстратов. Содержание аргинина определяют с помощью стабилизированной и усовершенствованной реакции Сакагучи (хроматограмму погружают в 0.1% раствор 8-гидроксихинолина в ацетоне, высушивают на воздухе, опрыскивают раствором 0.2 мл Br 2 в 100 мл 0.5 М NaOH; аргинин и другие гуанидины дают оранжево-красные пятна, тауромицин и гликоциамин - лишь временную окраску), позволяющей определить содержание аргинина в растворах трихлоруксусной кислоты после осаждения и удаления нерастворимых белков. Зная содержание аргинина в белковом субстрате и определяя его количество в перешедших в раствор пептидах, можно рассчитать процент гидролиза белкового субстрата изучаемыми протеиназами. В этом состоит главное преимущество метода, поскольку метод Ансона не дает возможности рассчитать процент гидролиза белка, атакуемого протеолитическими ферментами. Из всех существующих методов только метод Мура и Штейна позволяет определить процент гидролиза белковых субстратов, но он имеет ограниченное применение, поскольку требует предварительного проведения полного
полного кислотного гидролиза как белка-субстрата, так и образовавшихся пептидов. В предложенной методике калибровочная кривая строится по растворам свободного аргинина. Введение в реакцию пептидов и белков в виде их биуретовых комплексов повысило чувствительность реакции Сакагучи с остатками аргинина и сделало ее такой же чувствительной, как и для свободного аргинина. В качестве белкового субстрата используют классический субстрат - гемоглобин и окисленный по Сангеру лизоцим. Этот низкомолекулярный белок, содержащий 12.7% аргинина прекрасно расщепляется пепсином (рвется около 30 связей).
Прежде чем приступить к определению активности ферментов в изучаемых тканевых субстратах, необходимо:
1. Определить зависимость активности от рН и выбрать оптимальную реакцию среды для проявления активности изучаемого фермента.
2. Построить график зависимости активности фермента от времени его инкубации с субстратом. выбрать для работы те сроки инкубации, при которых сохраняется линейная зависимость между величиной активности фермента и временем его инкубации.
3. Определить зависимость величины активности от концентрации белка в пробе. Выбрать такие концентрации фермента, при которых величина активности фермента была бы пропорциональна его концентрации. Следует учитывать, что в тканевых экстрактах и биологических жидкостях могут присутствовать ингибиторы протеолитических ферментов. При разведении пробы их концентрация снижается , а протеолитических - увеличивается. Определяя “фактор разведения”, можно одновременно с подбором оптимальных условий для определения протеолитической активности выявить и наличие ингибитора.
4. При определении активности фермента необходимо работать при постоянной скорости ферментативной реакции, достигаемой при полном насыщении фермента субстратом, при так называемой максимальной скорости ферментативной реакции. В каждом отдельном случае максимальную скорость необходимо найти экспериментально, измерив активность препарата при разных концентрациях субстрата, при постоянных концентрациях белка и времени инкубирования.
Определение активности протеиназ по белковому субстрату.
К 0.5 мл субстрата в соответствующем буферном растворе добавляют 0.5 мл пробы, содержащей фермент (экстракт, биологическую жидкость), инкубируют установленное опытным путем время , после чего белки в пробе осаждают 5 мл 10% трихлоруксусной кислотой. Отделяют осадок центрифугированием, а надосадочную жидкость (ТХУ-центрифугат) подвергают дальнейшей обработке. Контрольные пробы - пробы, где реактив добавлен в обратном порядке: к 3 мл 10% раствора ТХУ добавляют 0.5 мл раствора, содержащего фермент и 0.5 мл субстрата. Рекомендуется ставить пробу на автолиз субстрата: к 0.5 мл субстрата добавляют 0.5 мл прокипяченного раствора, содержащего фермент, инкубируют вместе с опытными пробами и осажденной ТХУ.
Определение содержания аргинина в ТХУ-центрифугантах по модифицированной реакции Сакагучи. К 0.5 мл ТХУ-центрифуганта добавляют 0.5 мл 2.5мМ раствора CuSO 4 , 0.5 мл 5 Н. КОН, 0.5 мл раствора ДХН (2,4-дихлор-1-нафтол). Раствор встряхивают и вносят 0.5 мл гипобромита натрия, мгновенно возникает ярко-розовая окраска. Раствор встряхивают и через 20-30 секунд стабилизируют пробы добавлением 0.2 мл раствора 2-тиогликоля (чтобы предотвратить разрушение окрашенного продукта избытком гипобромита натрия. После добавления 2-тиодигликоля в пробы как опытные, так и контрольные, появляется желтоватое окрашивание за счет побочного продукта реакции между избыточной ТХУ и гипобромита натрия. Побочный продукт также стабилизируется 2-тиодигликолем. Оптическая плотность пробы измеряется спектрофотометром при 520 нм в кювете толщиной 1 см.
Определение активности протеиназ по реакции с реактивом Фолина. К 0.5 мл того же ТХУ-центрифуганта добавляют 0.5 мл 2.5 мМ раствора CuSO 4 , 4 мл 0.5 н. раствора NaOH и 1.5 мл разбавленного в три раза реактива Фолина. Через 30 минут измеряют на спектрофотометре оптическую плотность при 760 нм
Калибровочные кривые по пепсиновому гидролизату окисленного лизоцима. 30 мг окисленного лизоцима растворяют в 50 мл подкисленной воды (40 мл Н 2 О + 10 мл 0.3 н. раствора HСl. и к полученном раствору добавляют 0.5 мг пепсина. Смесь оставляют при комнатной температуре на сутки. По истечении этого срока инкубации препарат не дает осадка с ТХУ. Этот препарат используют наряду с растворами аргинина и тирозина в качестве стандарта для построения калибровочных кривых. Приготовляют разведения с содержанием от 60 до 600 мкг/мл исходного лизоцима. В пробы вводят соответствующее опытным пробам количество ТХУ. Приготовляют также растворы свободного аргинина и тирозина с концентрациями от 0.04 до 0.25 мкмоль/мл. Из каждой пробы берут по 0.5 мл (в трех параллельных пробах) для определения содержания аргинина и тирозина по Фолину.