И коллоидная химия (стр. 1 из 17)
Государственное образовательное учреждение высшего
профессионального образования
ПЕТРОЗАВОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
БИОЛОГИЧЕСКАЯ, ФИЗИЧЕСКАЯ
И КОЛЛОИДНАЯ ХИМИЯ
Методические указания
к лабораторным работам и контрольные вопросы и задачи для студентов II курса агротехнического факультета специальности «Зоотехния»
Петрозаводск
Издательство ПетрГУ
2007
Рассмотрены и утверждены к печати на заседании редакционной комиссии по отрасли науки и техники «биология» 11 сентября 2007 г.
Печатаются по решению редакционно-издательского совета
Петрозаводского государственного университета
Составители
В. В. Осташкова, канд. биол. наук;
В. П. Андреев, доктор хим. наук;
Я. П. Нижник, канд. хим. наук
ПРЕДИСЛОВИЕ
Настоящие методические указания содержат лабораторные работы по биологической, физической и коллоидной химии, выполняемые студентами II курса агротехнического факультета специальности «Зоотехния» в процессе изучения предмета. На лабораторных занятиях студенты овладевают методами экспериментальных исследований, закрепляют теоретические знания, анализируют полученные на практических занятиях результаты. В каждой лабораторной работе излагаются цель и задачи, поставленные перед студентом, принцип используемого метода, ход работы, предлагается проанализировать результаты проведенных исследований и сделать выводы. Представленные в конце каждого раздела вопросы и задачи способствуют лучшему усвоению теоретического материала при самоподготовке.
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
РАЗДЕЛ 1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В БИОХИМИИ
РАБОТА 1. КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ОКРАШЕННЫХ ВЕЩЕСТВ В РАСТВОРАХ. ПРИНЦИП И ТЕХНИКА КОЛОРИМЕТ-РИРОВАНИЯ. УСТРОЙСТВО И ПРАВИЛА РАБОТЫ НА КФК-2
Цель работы: ознакомиться с одним из наиболее распространенных в биохимии методов количественного определения веществ в исследуемом растворе.
Задачи:
· ознакомиться с основными принципами и правилами работы на КФК-2;
· измерить оптическую плотность двух окрашенных растворов;
· подобрать наиболее оптимальную длину волны и размер кюветы для определения оптической плотности предложенных растворов.
Фотометрия — метод количественного анализа, основанный на определении концентрации вещества по спектру поглощения, испускания или флуоресценции.
В зависимости от характера возникающих изменений выделяется несколько видов фотометрии (колориметрия, нефелометрия, турбидиметрия, флуориметрия, рефрактометрия, поляриметрия и др.). Фотометрические методы анализа характеризуются высокой чувствительностью, достигающей 10-4-10-6 % определяемого элемента в твердых образцах и 10-5-10-7 % – в водных растворах. Колориметрический метод получил самое широкое распространение среди биохимических методов количественного определения веществ в биологических объектах.
Принцип метода. В основе этого метода лежит закон Бугера-- Ламберта - Бера, согласно которому существует прямо пропорцио-нальная зависимость между концентрацией вещества в окрашенном растворе и степенью поглощения света данным раствором.
Интенсивность поглощения света зависит не только от количества и природы растворенного вещества, но и от толщины слоя раствора, длины волны падающего света, температуры раствора.
D = ecl,
где D - оптическая плотность;
e - коэффициент экстинкции (л/моль·см);
с - молярная концентрация (моль/л);
l- - толщина слоя раствора (см).
Степень поглощения света окрашенным раствором выражается оптической плотностью (экстинкцией), под которой понимают логарифм отношения интенсивности света, падающего на раствор, к интенсивности света, прошедшего через раствор [D = lg(I0/I)]. Величина оптической плотности обозначается буквой Е или D. Чем больше оптическая плотность, тем меньше света пропускает раствор. Для определения оптической плотности или светопропускания используют фотоэлектроколориметры.
1.Устройство фотоэлектроколориметра КФК-2
Колориметр фотоэлектрический концентрационный (КФК-2) предназначен для количественного определения веществ в окрашенных растворах по их оптической плотности или коэффициенту светопропускания в диапазоне волн 315-980 нм. КФК-2 состоит из оптического блока (передняя часть прибора), где находятся осветитель, светофильтр, оптика, кюветное отделение, фотометрическое устройство и регистрирующий прибор, и блока питания (задняя часть), где расположен стабилизатор напряжения с выпрямителем и силовой трансформатор.
Источником света в колориметре служит галогенная лампа. Приемниками излучения являются фотоэлемент Ф-26 для работы в диапазоне волн 315-540 нм и фотодиод ФД-24К для работы в специальном диапазоне 590-980 нм.
Световой поток лампы с помощью специальных устройств конденсируется, усиливается и проходит через светофильтр, кювету с исследуемым раствором и падает на приемник излучения. При этом световое излучение преобразуется в электрические сигналы, которые подаются на измерительный прибор. Показания микроамперметра пропорциональны световому потоку, проходящему через исследуемый раствор.
2. Выбор светофильтра
При проведении фотоэлектроколориметрии следует учитывать, что в данном методе используется монохроматический свет, причем различных длин волн. Для преобразования полихроматического света в монохроматический используются светофильтры. В КФК-2 имеется набор из 11 светофильтров. Использование конкретного светофильтра позволяет пропускать через раствор лучи определенной длины, поглощение которых наиболее характерно для исследуемого вещества. Обычно эффективная длина волны и цвет светофильтра указаны в применяемом методе. Если же такой ссылки нет, то выбрать нужный светофильтр можно с помощью таблицы.
Таблица
| Окраска исследуемого раствора | Цвет нужного светофильтра | Длина волны пропускаемого света, нм |
| Желтая | синий | 420 - 450 |
| Оранжевая | синий | 430 – 460 |
| Красная | зеленый | 460 - 500 |
| Пурпурная | зеленый | 490 - 530 |
| Синяя | оранжевый | 590 |
| Сине-зеленая | красный | 600 - 650 |
| Голубая | красный | 750 |
| Сине-фиолетовая | красный | 750 |
Примечание. Выбор светофильтра по данной таблице приблизителен, так как некоторые растворы одинакового цвета могут избирательно поглощать лучи с различной длиной волны. Поэтому при подборе светофильтра желательно знать спектр поглощения исследуемого вещества, причем выбор его осуществляют таким образом, чтобы он пропускал лучи с длиной волны, максимально поглощаемой исследуемым раствором. Таким образом, при выборе светофильтра оптимальной длиной волны окажется та, при прохождении которой через исследуемый раствор оптическая плотность будет максимальной.
3. Подбор кювет
Известно, что чем толще слой жидкости, через который проходит луч света, тем больше будет поглощение светового пучка и тем выше показание оптической плотности исследуемого раствора. К колориметру прилагается набор кювет, отличающихся расстоянием между рабочими гранями, через которые проходит световой поток. Это расстояние (в мм) указано на одной из рабочих граней. На боковой стенке кюветы имеется метка, до которой необходимо наливать жидкость. При работе с летучими растворами кюветы закрывают специальными крышками.
К каждому прибору прилагается набор кювет с толщиной слоя исследуемого раствора от 1 до 50 мм. Подбор кювет осуществляется таким образом, чтобы оптическая плотность исследуемого раствора не была ниже величины 0,15 и выше 0,7. Именно в этих пределах наиболее точно выполняется закон Бугера -- Ламберта - Бера. Следовательно, при интенсивной окраске раствора необходимо взять кюветы с меньшим расстоянием между рабочими гранями, а при слабой окраске – с большим расстоянием.
4. Общая схема прибора и обозначения
1 - рукоятка установки светофильтра (около рукоятки маркировка по длине волны);
2 – ручка перемещения кювет в кюветном отделении;
3 – ручка включения чувствительности фотоприемников (обозначена цифрами 1, 2 и 3 черного цвета при работе в диапазоне волн от 315 до 540 нм и красного цвета - в диапазоне от 590 до 980 нм);
4 – микроамперметр (имеет две шкалы: по верхней измеряют коэффициент светопропускания, а по нижней – оптическую плотность раствора);
5 – ручка «грубой» настройки микроамперметра;
6 – установка «точной» настройки микроамперметра;
7 – крышка кюветного отделения.
5. Правила работы на КФК-2
I. Подготовка прибора к работе
1. Установить нужный светофильтр (рукоятка 1).
2. Рукоятку 3 (чувствительность фотоэлемента) установить на цифру 1 соответствующего цвета: при работе в диапазоне волн от 315 до 540 нм чувствительность обозначена цифрами черного цвета, в диапазоне от 590 до980 нм – красного цвета.