Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
1 апреля 2009 года
Дата введения -
1 июня 2009 года
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОРГАНИЗАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ИЗ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ
ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2494-09
1. Разработаны ФГУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора, ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, ФГУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Воронежской области, Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 марта 2009 г. N 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко и введены в действие 1 июня 2009 г.
4. Введены впервые.
1. Область применения
1.1. Методические указания предназначены для использования специалистами органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами лечебно-профилактических организаций, научно-исследовательских институтов и других заинтересованных организаций.
1.2. В настоящих Методических указаниях определены основные правила сбора полевого и клинического материала, предназначенного для анализа на хантавирусы методом ПЦР. Описаны порядок упаковки, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологических образцов, зараженных или подозрительных на зараженность хантавирусами. Предложены унифицированные методические подходы для проведения молекулярно-генетических исследований по генотипированию хантавирусов.
2. Нормативные ссылки
2.1. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)".
2.2. СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности".
2.3. МУ 3.1.1029-01 "Отлов, учет и прогноз численности мелких млекопитающих и птиц в природных очагах инфекций".
2.4. МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности".
2.5. СП 3.1.099-96 "Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом".
3. Общие положения
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - вирусный нетрансмиссивный зооноз, широко распространенный в Евразии, а в России занимающий первое место по заболеваемости среди природно-очаговых инфекций. Возбудители ГЛПС - вирусы Пуумала, Хантаан, Сеул, Добрава и Амур - относятся к роду Hantavirus (семейство Bunyaviridae), который включает в настоящее время более 30 различных хантавирусных серотипов или генотипов. Большинство из них являются патогенными для человека. Хантавирусы эволюционно тесно связаны с определенными видами грызунов из семейств Arvicolinae и Murinae (полевки, мыши, крысы). Вирусы передаются преимущественно респираторным путем, а источником заражения людей служат теплокровные носители, выделяющие вирус с экскретами во внешнюю среду.
На территории России эпидемически активные очаги ГЛПС расположены в основном в умеренных широтах европейской части и на Дальнем Востоке. Более 95% случаев заражения ГЛПС происходят в европейских очагах, приуроченных к лесным ландшафтам. Здесь циркулирует хантавирус Пуумала, основным резервуаром которого в природе является европейская рыжая полевка (Myodes glareolus). Наиболее активная очаговая территория расположена в оптимуме ареала рыжей полевки - в широколиственных и хвойно-широколиственных лесах Приуралья и Среднего Поволжья. Почти 90% всех зарегистрированных случаев заражения ГЛПС в Российской Федерации приходится на Приволжский федеральный округ. В дальневосточных регионах России ГЛПС вызывается хантавирусами Хантаан, Амур и Сеул, природным резервуаром которых являются полевая мышь (Apodemus agrarius), восточно-азиатская мышь (Apodemus peninsulae) и серая крыса (Rattus norvegicus) соответственно.
Полученные в последнее десятилетие данные существенно меняют сложившиеся представления об этиологической природе заболеваемости ГЛПС на европейской части России, где ранее все случаи заражения ГЛПС связывали с вирусом Пуумала.
В ходе комплексных клинико-эпидемиологических, эпизоотологических и лабораторных исследований были выявлены природные очаги, где циркулируют ранее неизвестные, высоко патогенные для человека вирусы - возбудители ГЛПС, относящиеся к двум иммунологически и генетически отличающимся подтипам вируса Добрава. Один из них обнаружен в популяции кавказской лесной мыши (Apodemus ponticus) в субтропической зоне Краснодарского края (Большой Сочи), другой - у полевых мышей (Apodemus agrarius) в центральных областях европейской части России. Установлено, что штаммы из этих регионов имеют существенные биологические отличия, характеризуются значительной генетической разнородностью и различным уровнем вирулентности.
В последние годы были обнаружены новые природные очаги вируса Добрава на территории Самарской, Астраханской и Омской областей. Однако окончательный вывод об ареале подвидов вируса Добрава и нозоареале ГЛПС - ДОБ на территории России можно будет сделать лишь после проведения более широких исследований.
Многообразие клинических проявлений, а также существование стертых и атипичных клинических форм при ГЛПС нередко затрудняет дифференциальную диагностику болезни, в связи с чем для верификации диагноза необходимы лабораторные исследования. Для специфической диагностики ГЛПС в России широко применяются 2 вида диагностикумов: для проведения непрямого МФА (для серодиагностики ГЛПС у больных) и ИФА для выявления хантавирусного антигена.
В свете задач по совершенствованию специфической диагностики ГЛПС, повышения качества и эффективности проводимых исследований, своевременного реагирования в случае возникновения эпидемических проявлений хантавирусных инфекций на территории Российской Федерации актуальным является более широкое применение молекулярно-генетических методов. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является практически единственным методом, позволяющим осуществлять прямую детекцию хантавирусов в полевом и клиническом материале. Преимущества молекулярно-генетических методов приобретают особое значение при изучении хантавирусов, поскольку эти вирусы плохо размножаются в клеточных культурах, не обладают цитопатическим действием и не имеют удачной лабораторной модели инфекции. В некоторых случаях геном хантавирусов был охарактеризован задолго до того, как были выделены хантавирусные штаммы, либо, когда выделение вируса вовсе не представлялось возможным.
4. Сбор, хранение и транспортирование
материалов, предназначенных для исследования
молекулярно-генетическими методами
4.1. Мониторинг за возбудителями ГЛПС, исследование биологического материала иммунологическими методами проводят на базе федеральных государственных учреждений здравоохранения "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации. Проведение ПЦР осуществляется в специализированных лабораториях, имеющих необходимый набор помещений, укомплектованных сертифицированным ПЦР-оборудованием в строгом соответствии с требованиями МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности". Исследования проводят врачи, прошедшие обучение на курсах повышения квалификации и получившие сертификат специалиста по генодиагностике инфекционных заболеваний. Порядок ПЦР-исследований материала, подозрительного на зараженность хантавирусами, проводимых на базе специализированных лабораторий, определен ниже (п. п. 4.2 - 4.4, 6.1 - 6.5).
4.2. Сбор клинического материала осуществляет медицинский персонал лечебно-профилактического учреждения, обученный правилам работы с ООИ. Наиболее информативным клиническим материалом для исследования методом ПЦР является кровь (плазма крови) от больных ГЛПС, полученная не позднее 8 сут. от начала заболевания. Взятие крови у больных пациентов проводится в герметично закрывающуюся пробирку с 6%-ным раствором ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) в соотношении 1:20 или пробирку с 3,8%-ным раствором цитрата натрия в соотношении 1:9. Использование гепарина в качестве антикоагулянта не допускается. Для получения плазмы закрытые пробирки с кровью несколько раз переворачивают для смешивания с консервантом и затем центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 3 - 5 мин. Чтобы не допускать повторного замораживания проб, аликвоты плазмы предварительно разливают по 200 - 300 мкл в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл. Для выделения РНК используют 100 мкл плазмы крови, остаток материала замораживают и сохраняют при температуре минус 20 °C до конца исследования.
4.3. Сбор полевого материала для исследования на хантавирусы, а также отлов мышевидных грызунов и учет их численности проводится в соответствии с нормативными методическими документами.