Для диспергирования сорбента в суспензии успешно применяют энергичное встряхивание или перемешивание, которое не должно приводить к измельчению сорбента. Для лучшего диспергирования применяют ультразвуковые ванны, при этом указывают как на преимущество на дегазацию суспензии. Однако длительное использование ультразвукового излучателя большой мощности, погруженного в суспензию для диспергирования, нежелательно ввиду возможного измельчения частиц сорбента при соударении и ухудшения при этом фракционного состава сорбента.
Резервуар, в который заливают суспензию для последующей подачи ее в колонку, прежде всего, должен быть прочным. Его рассчитывают и спрессовывают при давлении, не менее чем на 20 МПа превышающем давление при упаковке колонки. Его изготовляют обычно из трубки диаметром в 2-4 раза больше, чем у колонки, и стандартных фитингов-соединителей для трубок разного диаметра с применением обжимаемых конусов. Зная количество сорбента в колонке и концентрацию суспензии, рассчитывают требуемый объем резервуара и отрезают трубку нужной длины. Целесообразно иметь несколько резервуаров из трубок разной длины, но одного диаметра, к которым подходят два фитинга-соединителя. Переставляя фитинги, вы всегда будете иметь резервуар нужного для данной колонки объема.
Широко распространены резервуары для суспензии, выточенные из нержавеющей стали. Он представляет собой стакан с крышкой, к которой приварены или присоединены на конической резьбе фитинги для присоединения колонки и подвода растворителя. Крышка может соединяться с корпусом при помощи прокладок из инертных пластмасс или мягких металлов либо на конусах. Крышка соединяется с корпусом и герметизируется затяжкой болтов или же с помощью резьбы. Такие резервуары иногда устраивают по типу автоклавов с магнитными или механическими мешалками. Мешалку используют для приготовления суспензии в резервуаре и для поддержания ее в стабильном состоянии в процессе упаковки колонки. Это позволяет избежать седиментации сорбента из маловязких растворителей в процессе набивки, повышает однородность набивки и упрощает выбор растворителя.
Важно правильно выбрать насос для набивки колонки. Можно использовать для набивки насосы постоянного расхода или насосы постоянного давления. Однако как тот, так и другой тип насоса должен обеспечивать определенные минимальные данные по расходу и давлению растворителя.
Первый и наиболее распространенный вопрос, который приходится слышать от начинающего хроматографиста, — можно ли применять для упаковки колонок и предколонок тот насос, который уже есть в хроматографе. На современных хроматографах обычно устанавливают насос, способный подавать растворитель при давлении 30— 50 МПа и расходе 5—10 мл/мин. Безусловно, с помощью такого насоса можно упаковать современную высокоэффективную аналитическую колонку и предколонку. Однако учтите, что придется на время набивки отказаться от аналитической работы; насос при набивке будет работать на предельных режимах по давлению; полученные колонки будут стабильно работать при давлениях, примерно на 10—15 МПа ниже максимально возможных для вашего насоса. Поэтому решайте сами, приобретать ли отдельную систему, специально рассчитанную на работу в форсированном режиме для набивки колонок. Такая система включает насос постоянного расхода, рассчитанный на подачу растворителя с давлением 20—150 МПа и расходом 200—300 мл/мин. Такой насос работает по принципу пневмогидравлического усиления давления, в качестве источника энергии используется сжатый воздух под давлением 0,6— 1,2 МПа при коэффициенте усиления давления от 30 до 150. Он позволяет упаковывать колонки любого типа (аналитические, препаративные полупрепаративные и микроколонки).
Какое направление потока лучше при набивке колонок — снизу вверх или сверху вниз — оживленно обсуждается. Однако полученные результаты не позволяют предпочесть ни тот, ни другой вариант. Неизвестно, какой растворитель лучше для подачи суспензии в колонку — тот же, что использован для приготовления суспензии, или другой. Наилучшим следует признать такой растворитель, который дает упаковку хорошего
качества и позволяет быстро уравновесить колонку с рабочим растворителем. Однако когда стоит конкретный вопрос о выборе растворителя - только литературные данные или опыт могут дать ответ.
Выбрать давление при набивке колонки очень сложно. Есть авторы, заявляющие о превосходной упаковке при давлении 3 МПа, другие настаивают на необходимости работать при 100-200 МПа. Начинающий исследователь старается выбрать высокое давление, полагая, что упаковка при этом будет более плотной, а колонка - более эффективной. Исходить надо из следующих представлений. Конусные уплотнения на современных аналитических колонках достаточно надежно работают (при правильной затяжке) до давления 40-60 МПа. Некоторые силикагели, используемые в качестве матрицы, разрушаются при давлениях 20-30 МПа. Органические гели, как правило, могут работать при давлениях, не превышающих 5-10 МПа. Исходя из этого, следует принять для набивки колонок давление 20-60 МПа при использовании сорбента с силикагелевой матрицей.
При работе с новым видом сорбента или с новой партией следует упаковать сначала короткую колонку (10-12 см) при относительно невысоком давлении (20-25 МПа). При хорошем результате можно попытаться упаковать более длинную (200-250 мм) колонку при высоком давлении (40-60 МПа). Если эффективность увеличится примерно вдвое одновременно с увеличением сопротивления потоку в два раза, значит сорбент прочен, его можно использовать при таких параметрах набивки. Если сопротивление потоку возрастет в 2,5-6 раз, это значит, что сорбент непрочен и разрушается, образующаяся пыль резко увеличивает сопротивление колонки, нужно снижать давление при набивке. Особую осторожность следует проявлять при выборе давления для набивки силикагелей с широкими порами (более 10 нм) и с большим объемом пор, которые находят все более широкое применение в эксклюзионной хроматографии полимеров и в анализе биологических объектов - белков, полипептидов и др.
При упаковке колонки можно считать оптимальным объем поданного растворителя, в 4-6 раз превышающий объем резервуара для суспензии.
После того как нужный объем растворителя подан при упаковке колонки, следует перекрыть соответствующий кран. Поток растворителя останавливается тем медленнее, чем мельче зернение сорбента, длиннее колонка, более вязкий растворитель и больше объем резервуара для суспензии. До полной остановки потока из колонки, что отнимает обычно 1-6 мин, ни в коем случае не следует отсоединять колонку, так как слой сорбента в колонке может быть разрыхлен при резком снижении давления. После остановки потока растворителя следует отсоединить колонку от системы набивки, осторожно лезвием бритвы срезать выступающий слой сорбента заподлицо с концом колонки, снять излишки сорбента с трубки и конуса, положить фильтр на сорбент, аккуратно одеть фитинг, завернуть и затянуть гайку сначала от руки, а затем с помощью двух ключей. Затем устанавливают две заглушки, предотвращающие высыхание сорбента, после чего колонка считается готовой к хранению или тестированию.
При переходе к новой системе растворителей следует помнить, что она должна смешиваться с предыдущей системой, не вызывая при этом разделения на две несмешивающиеся фазы. Если это может произойти (например, при переходе от системы метанол - вода к системе гексан- изопропанол или от системы фосфатный буферный раствор к системе метанол - вода или ацетонитрил-вода), надо промыть колонку промежуточным растворителем, полностью смешивающимся с обеими системами растворителей. В противном случае выделившаяся гетерофаза (в приведенных примерах - это вода и соль) вызовет множество проблем: нестабильность характеристик удерживания; дрейф и нестабильность нулевой линии детектора; повышение давления на входе в колонку; искажение формы пиков; забивку капилляров и инжектора; «залипание» клапанов и т.д. Выбирая промежуточный растворитель, следует принимать во внимание его вязкость, поглощение в УФ-области и другие характеристики. Иногда приходится вести промывку даже двумя промежуточными растворителями, чтобы избежать разделения старой и новой систем растворителей на гетерогенные фазы.
Рассмотрим использование при набивке предколонки, которую устанавливают между резервуаром для суспензии и набиваемой колонкой. Некоторые исследователи считают, что такая предколонка играет важную роль в повышении качества получаемой колонки, так как она служит продолжением колонки и, имея тот же самый диаметр и соединение с колонкой «вплотную», позволяет избежать нарушения однородности слоя набивки в начале колонки, забирает излишек сорбента, предотвращает (частично) возможность выпадения сорбента из ковки обратно в резервуар и удерживает все примеси, попадающие из растворителя при его прокачке. Нам не удалось отметить заметной разницы в качестве колонок, заполненных с такой предколонкой и без нее; однако в некоторых случаях применение такой предколонки целесообразно. Ее можно использовать как предколонку, заполняемую одновременно с колонкой. Если при длительной работе такой системы верхний слой сорбента загрязняется или проседает, почти всегда можно отсоединить предколонку и, одев фитинг уже на колонку, восстановить ее работоспособность без замены сорбента.
Укажем три одинаково эффективных метода набивки колонок силикагелем.
I Набивку проводят при направлении потока «снизу вверх», используя маловязкие растворители.
1. Взвесить в конической колбе вместимостью 50 мл 2,6— 3,0 г (для колонки размером 4,6 мм Х25 см) силикагеля зернением 5, 7 или 10 мкм, добавить 20 мл метанола и закрыть крышкой.
2. Тщательно промыть и высушить колонку, резервуар для суспензии и все фитинги, пометить фитинги и концы колонки «к детектору» и «к инжектору».