Введение
Общее представление о росте и развитии
Дифференцировка.
Тотипотентность.
Культура каллусных тканей и их морфогенетические особенности.
Суспензионная культура.
Культуры отдельных клеток.
Применение культур растительной ткани. Фундаментальные и практические аспекты.
Вспомогательное использование методов invitro в селекции растений.
Преодоление постгамной несовместимости.
Клональное микроразмножение отдаленных гибридов.
Гибридизация соматических клеток.
Слияние изолированных протопластов.
Заключение.
Приложения.
Литература.
Введение
Клеточная биотехнология базируется на использовании культуры клеток, тканей и протопластов. Для того чтобы манипулировать клетками, нужно выделить их из растения и создать такие условия, при которых они могли бы жить и размножаться вне растительного организма. Метод культивирования изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (invitro) получил название культуры изолированных тканей и приобрёл особое значение в связи с возможностью его использования в биотехнологии.
Культура клеток высших растений может рассматриваться с трёх точек зрения – как уникальная биологическая система, как модель в физиологии растений и как инструмент для разнообразных исследований и биотехнологий. Изолированные растительные клетки способны продуцировать ценные для медицины, парфюмерии и других отраслей промышленности вещества вторичного синтеза (вещества не участвующие в основном обмене веществ): алкалоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и т.д. Продуктивность культивируемых клеток в результате клеточной селекции может значительно превышать продуктивность целых растений. Использование изолированных культур клеток в селекции, дают возможность получать быстрорастущие растения, устойчивые к различным неблагоприятным факторам среды. Вместе с тем, это направление предусматривает создание новых растений путём слияния изолированных протопластов и получение соматических гибридов. Перенос в изолированные протопласты чужеродных генов с помощью методов генной инженерии позволяет получать в дальнейшем растения с новыми наследуемыми свойствами. Культура клеток как экспериментально созданная биологическая система интересна сама по себе и является объектом исследования узкого круга специалистов. Как модель, клетки invitro представляют интерес для многих физиологов и биохимиков растений. Очевидно, что адекватно использовать культуру клеток как модель можно тогда, когда чётко представляешь её свойства, как биологической системы. И, наконец, как инструмент фундаментальных и прикладных исследований. Статус экспериментально созданной биологической системы обусловлен свойственной культурам клеток изменчивостью, наследуемостью возникших изменений, адаптивным отбором и эволюцией. В некотором роде её можно считать микропопуляцией, основное отличие которой от природных популяций - это отсутствие полового размножения особей, т.е. клеток. Можно выделить две принципиальные особенности культуры клеток растений как биологической системы: во-первых, отсутствие организменного контроля развития, и во-вторых - избыточный генетический материал. Культивируемые клетки и ткани могут служить адекватными моделями для исследований различных направленностей, например метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения. И для более глубокого понимания данных процессов и явлений часто используются методы создания биохимических мутантов, гибридных и трансформированных клеток в пределах исследуемой культуры. Простота клеточных моделей, возможность быстро получать достаточную массу в асептических, контролируемых по многим параметрам условиях являются преимуществами такого моделирования. В отношении синтеза вторичных метаболитов культуры клеток также обладают рядом достоинств, а именно возможность использования для этой цели растения, не произрастающие в наших природных условиях, и получать продукцию круглый год. Тем не менее, проблемы клеточных и молекулярных основ морфогенеза, не говоря уже о механизмах морфогенеза, остаются малоизученными. Прежде всего, это концепция тотипотентности растительной клетки и её влияние на стратегию исследовательской работы с культурой тканей и клеток растений. Постулат этой концепции о первичности внешнего сигнала в морфогенетическом ответе растительной клетки во многом определил экстенсивный характер исследований в области культуры клеток растений. Второй причиной является сложность морфогенетических процессов, которые позволяют моделировать и изучать культуры клеток и тканей. Известно, что в культуре invitro может осуществляться реализация нескольких морфогенетических программ, а именно зародышевого развития и некоторого органогенеза. Возможность моделирования в культуре invitro более простых процессов, например гистогенеза и цитодифференцировок представляется затруднительнее. Однако, в рамках исследования эти проблемы вполне преодолимы, при индивидуальной разработке методики и постановки эксперимента.
Общее представление о росте и развитии
О росте растений, казалось бы, можно судить по увеличению общей биомассы. Однако этот показатель весьма неоднозначен, поскольку сырая биомасса может не только увеличиваться, но и уменьшаться. Ещё один показатель роста – это увеличение числа клеток. Если число клеток растёт, можно уверенно говорить о росте, но постоянное число клеток ещё не говорит об отсутствии роста: в зоне растяжения увеличение числа клеток незначительно, тем не менее, рост идёт. О росте можно судить по увеличению линейных размеров – высоты растения, длины корня, ширины листа и т.д.
Таким образом, ростом можно называть необратимое увеличение растения хотя бы по одному из параметров: число клеток, линейные размеры, сырая/сухая биомасса.
Упрощённой моделью изменения параметров роста от времени является «кривая роста». Более подробно я буду говорить о ней ниже. Следует только отметить, что характер этой кривой способен резко меняться, в связи с действием на растение массы внешних факторов. Общая кривая роста, часто оказывается составленной разномасштабными S – образными участками. Таким образом, кривая роста целого растения обычно имеет более сложную форму.
Термин дифференцировка был введён для обозначения процесса приобретения различий между клетками (тканями, органами, системами органов и т.д.). Предполагается, что есть начальное недифференцированное состояние, когда наблюдатель не может установить различий между клетками, затем появляются видимые различия клеток и они становятся дифференцированными. Традиционно недифференцированными считают: делящиеся клетки эмбриона; меристематические клетки апексов корня и стебля, камбия, феллогена, интеркалярных меристем; клетки,_неорганизованно делящиеся в экспериментальных условиях (суспензионная и каллусная культура invitro).
Клетки, покинувшие зону деления, приступают к дифференцировке. Результат этого процесса можно увидеть, например, при образовании проводящей системы: возникает прокамбий, который дифференцируется на флоэму, ксилему и камбий. Во флоэме дифференцируются ситовидные элементы и клетки-спутницы, в ксилеме — паренхимные клетки и трахеиды, проводящий пучок может быть усилен дифференцирующимися механическими тканями и т.д. В данном примере клетки поэтапно приобретают анатомические различия в связи с выполняемыми функциями, многообразие клеток растет.
Анатомической дифференцировке предшествует биохимическая дифференцировка, когда видимых различий между клетками мало, но они, не одинаковы по содержанию тех или иных веществ.Удобнее следить за дифференциальной эспрессией генов: появлением новых или снижением уровня старых мРНК и белков. Эти данные позволяют зарегистрировать различия между клетками раньше, чем они станут видимыми на анатомическом уровне. Таким образом, дифференцировка начинается с изменения активности генома, экспрессии одних генов и подавления активности других.
При таком подходе делящиеся клетки меристемы придется считать дифференцированными, так как для прохождения клеточного цикла нужна определённая активность генома, которая и будет отличать эти клетки от других. Анатомы давно обратили внимание на неоднородность клеток меристемы. Можно сказать, что апикальная меристема корня дифференцирована на каллиптроген (инициали чехлика), дерматоген (инициали эпидермальной ткани), инициали коры, покоящийся центр и инициали осевого цилиндра. Для каждой из групп делящихся клеток характерны определенная локализация, направление веретена делений и тип производных клеток. Исследование меристемы методами молекулярной генетики показывает, что обнаруженная анатомами дифференцировка меристемы на зоны совпадает с зонами дифференциальной экспрессией определенных генов. Более того, саму меристему в целом можно достаточно четко выделить по зонам дифференциальной экспрессии. Таким образом, меристема является биохимически дифференцированной тканью.
Дифференциальная экспрессия генов — фундаментальное проявляение дифференцировки, и, как это ни парадоксально, недифференцированных клеток вообще не существует. Понятие «недифференцированный» хорошо работает только там, где в соответствии с задачами исследования исходные различия между клетками не учитывают (или нет методов их обнаружить).
Генетический анализ процесса развития предполагает его разложение на ряд промежуточных этапов, каждый из которых контролируется определённой генетической системой. Развитие есть результат совместной, возможно сменяющей друг друга активности двух генетических систем – первичной и вторичной. Под первичной системой понимается генетический контроль, жёстко регламентирующий переход развивающейся системы из одного состояния в другое, а под вторичной генетической регуляцией – способность системы достигать некоторого конечного состояния автоматически или авторегуляторно.