На правах рукописи
Мухина Елена Станиславовна
АКТИВНОСТЬ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ ПРЕНАТАЛЬНО АЛКОГОЛИЗИРОВАННЫХ КРЫС
03.00.04 – Биохимия
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель доктор биологических наук профессор Генгин М. Т.
ПЕНЗА 2003
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………….……………….…...4
ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….……5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………….…...8
1.1. Влияние хронической алкоголизации на организм ……………………...8
1.2. Влияние пренатального хронического воздействия этанола на организм…………………………………………………………………..……..16
1.3. Ферменты обмена регуляторных пептидов …………………………...…21
1.3.1. Биологическая роль пептидаз…………………………….……………..21
1.3.2. Карбоксипептидаза Н…………………………………………………....23
1.3.3. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза………….……..……………28
1.4. Регуляторные пептиды и ферменты их обмена в онтогенезе…...…..….31
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………….37
2.1. Материалы исследования…………………………………………..……...37
2.2. Методы исследования………………………………………………………37
2.2.1. Моделирование хронического потребления этанола………………....37
2.2.2. Метод определения активности ферментов……………………….…..38
2.2.3. Метод проведения теста «открытое поле»…………………….……....39
2.2.4. Статистическая обработка результатов исследования………………....40
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………….……..…41
3.1. Исследование активности основных карбоксипептидаз в тканях крыс разного возраста, испытавших пренатальное воздействие этанола...……….41
3.1.1. Исследование активности карбоксипептидазы Н в тканях пренатально алкоголизированных крыс разного возраста………..……………………….41
3.1.2. Исследование активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях пренатально алкоголизированных крыс разного возраста………….49
3.2. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность основных карбоксипептидаз в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола……………………...……………………..57
3.2.1. Исследование поведения пренатально алкоголизированных животных в тесте «открытое поле»………………………………………………..…………57
3.2.2. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность карбоксипептидазы Н в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола………………………….……………………………..…..61
3.2.3. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола ……………………………..68
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ……………74
ВЫВОДЫ…………………………………….…………………………………..88
ЛИТЕРАТУРА….………………………………………………………………..91
АДГ – алкогольдегидрогеназа
АКТГ – адренокортикотропный гормон
АПМЯК – аминопропилмеркаптоянтарная кислота
АПФ – ангиотензинпревращающий фермент
ВИП – вазоактивный интестинальный пептид
ВНД – высшая нервная деятельность
ГАМК – гамма-аминомасляная кислота
ГОМК – гамма-оксимасляная кислота
ГГС – гипоталамо-гипофизарная система
ГГГС – гипоталамо-гипофизарно-гонадная система
ГГНС – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система
ГПЯК – гуанидинопропилянтарная кислота
ГЭМЯК – гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота
КП – карбоксипептидаза
КПN – карбоксипептидаза N
КПВ – карбоксипептидаза В
КПН – карбоксипептидаза Н
КРФ – кортикотропин-рилизинг фактор
НАД – никотинамидаденин динуклеотид
НАДФ – никотинамидадениндинуклеотид фосфат
ПОМК – проопиомеланокортин
Р0, Р14, Р28, Р45, Р120 – возраст животных (0, 14, 28, 45 и 120 суток после рождения, соответсвенно)
ФМСФ – фенилметилсульфонилфторид
ФМСФ-КП – фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза
ЦНС – центральная нервная система
ЭДТА – этилдиаминтетраацетат натрия
Для современной биологии и медицины имеет особую значимость исследование общих и частных закономерностей развития алкоголизма. Решение указанных вопросов позволит раскрыть патогенетические механизмы этого заболевания и разработать эффективные способы его профилактики и лечения.
Одним из важных аспектов проблемы алкоголизма является исследование нарушений, происходящих в организме потомков алкоголиков, и формирования у них предрасположенности к алкоголизму. При этом вызывают интерес процессы, происходящие в онтогенезе. Известно, что в ходе индивидуального развития организма происходит зависящая от пола перестройка различных функциональных и, особенно, регуляторных систем: нервной и эндокринной [12]. Эта перестройка сопровождается значительными изменениями в функционировании пептидергических систем, например опиоидных, что, несомненно, связано с изменением активности ферментов, участвующих в обмене биологически активных пептидов [1, 25, 52, 55, 76, 212, 278].
Биологически активные пептиды функционируют в качестве гормонов, нейрогормонов, нейромодуляторов, нейромедиаторов [76], вовлекаясь в регуляцию практически всех процессов, протекающих в организме, а также в развитие многих патологических процессов [76, 120]. Известна роль многих регуляторных пептидов, особенно опиоидных пептидов, в патогенезе алкоголизма [7, 13, 18, 62, 69, 120, 128, 272].
Уровень биологически активных пептидов в организме во многом зависит от активности ферментов, участвующих в процессинге их предшественников, модуляции и инактивации [35, 48, 52, 56, 115, 126, 140, 142, 160, 172, 174, 205].
К ферментам, участвующим в метаболизме регуляторных пептидов, относятся, в частности, основные карбоксипептидазы – это экзопептидазы, катализирующие отщепление остатков аргинина и лизина с С-конца пептидов. К ним относятся карбоксипептидаза В (КФ 3. 4. 17.1 ), карбоксипептидаза Н (КФ 3. 4. 17. 10), карбоксипептидаза М (КФ 3. 4. 17. 12), карбоксипептидаза N(КФ 3. 4. 17. 3), лизосомальная карбоксипептидаза В (КФ 3. 4. 17. 2), ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза и некоторые другие.
На настоящий момент возрастные и половые изменения активности ферментов обмена регуляторных пептидов, происходяшие в онтогенезе у потомков алкоголиков не изучены. Также нет данных об изменениях активности этих ферментов у пренатально алкоголизированных особей при последующем воздействии этанола в постнатальном периоде.
Целью нашей работы было изучение роли основных карбоксипептидаз в развитии предрасположенности к формированию алкогольной зависимости у потомков алкоголиков.
При выполнении работы были поставлены следующие задачи:
Исследовать активность карбоксипептидаз Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях пренатально алкоголизированных животных разного возраста.
Исследовать влияние хронической постнатальной алкоголизации на активность основных карбоксипептидаз в тканях взрослых крыс, подвергавшихся и не подвергавшихся воздействию этанола в эмбриональном периоде жизни.
Сравнить влияние алкоголизации на активность КПН и ФМСФ-КП у животных разного пола.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучено влияние пренатальной алкоголизации на активность КПН и ФМСФ-КП в тканях самок и самцов крыс. При этом исследована ферментативная активность как у взрослых животных, так в период их полового созревания. Установлена зависимость изменения активности КПН и ФМСФ-КП от пола и возраста животных. Показано половое отличие изменения активности ферментов в тканях пренатально алкоголизированных животных при постнатальной хронической этанольной интоксикации.
Полученные результаты представляют интерес для понимания механизмов функционирования пептидэргических систем и роли основных карбоксипептидаз в норме и при алкоголизме.
Положения, выносимые на защиту:
1. На основе анализа возрастной динамики, регионального распределения активности карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы и сравнения их с уровнем биологически активных пептидов, обсуждается биохимическая функция данных ферментов.
2. Пренатальная алкоголизация вызывает изменение активности исследованных ферментов в мозге и периферических тканях животных обоего пола в процессе развития.
3. Пренатальная алкоголизация модулирует изменение активности КПН и ФМСФ-КП при последующей постнатальной алкоголизации взрослых особей.
4. Предложена гипотетическая схема одного из возможных механизмов формирования предрасположенности к алкоголизму у пренатально алкоголизированных особей с участием исследованных ферментов.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 2-ой Всеросийской научно-практической конференции (Волгоград, 2003) и итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава Пензенского Государственного Педагогического Университета (2002, 2003 г.г.). По теме диссертации опубликовано 10 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 6 разделов: введение, обзор литературы по теме диссертации, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы. Работа изложена на 122 страницах, иллюстрирована 16 рисунками и 13 таблицами. Список литература содержит 353 наименования на русском и иностранных языках.
Эндогенные этанол и ацетальдегид являются одной из важных метаболических систем организма животных и человека, обмен этих веществ – неотъемлемая часть систем поддержания гомеостаза [21, 24, 63, 71, 92, 176, 184, 314, 329].
Экзогенный этанол, поступающий в организм животных и человека, окисляется тремя ферментативными системами: 1) алкогольдегидрогеназой с участием НАД, метаболизирующей 75-90 % поступившего этанола; 2) микросомальной этанолокисляющей системой с участием НАДФ и О2, окисляющей ~ 10 % этанола; 3) каталазой, окисляющей ~ 2 % этанола [78, 81, 82, 89, 336].