ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В.Г. БЕЛИНСКОГО
На правах рукописи
Салдаев Дамир Абесович
АКТИВНОСТЬ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ МЫШЕЙ ПРИ ВВЕДЕНИИ ТЕСТОСТЕРОНА И ПРОГЕСТЕРОНА
03.00.04 - Биохимия
Диссертация на соискание
ученой степени кандидата
биологических наук
Научные руководители:
кандидат биологических наук
профессор Генгин М.Т.,
кандидат биологических наук доцент Вернигора А.Н.
ПЕНЗА – 2000
содержание
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Нейропептиды и их обмен
1.2. Физико-химические свойства, субстратная специфичность и биологическая роль карбоксипептидазо-В-подобных ферментов
1.2.1. Карбоксипептидаза Н
1.2.2. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза
1.3. Половые стероидные гормоны
1.3.1. Тестостерон
1.3.2. Прогестерон
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материал исследования
2.2. Методы исследования
2.2.1. Метод введения половых стероидных гормонов
2.2.1. Метод определения активности карбоксипептидазы Н
2.2.2. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы
2.2.3. Метод определения концентрации белка
2.2.4. Статистическая обработка результатов исследования
ГЛАВА 3. Результаты исследования
3.1. Тканевое распределение активности основных карбоксипептидаз у самцов и самок мышей
3.1.1. Распределение активности карбоксипептидазы Н в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системе самцов и самок мышей
3.1.2. Распределение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системе самцов и самок мышей
3.2. Активность основных карбоксипептидаз у самок мышей при введении тестостерона и прогестерона
3.2.1. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении тестостерона в тканях самок мышей
3.2.2. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении прогестерона в тканях самок мышей
3.3. Активность основных карбоксипептидаз у самцов мышей при введении тестостерона и прогестерона
3.3.1. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении тестостерона в тканях самцов мышей
3.3.2. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении прогестерона в тканях самцов мышей
3.4. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы in vitro при действии тестостерона и прогестерона
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА
АКТГ – адренокортикотропный гормон
АПМЯК – аминопропилмеркаптоянтарная кислота
ГАМК – гамма-аминомасляная кислота
ГОМК – гамма-оксимасляная кислота
ГГГС – гипоталамо-гипофизарно-гонадная система
ГГНГС – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадная система
ГГНС – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система
ГнРФ – гонадотропин-рилизинг-фактор
ГПЯК – гуанидинопропилянтарная кислота
ГЭМЯК – гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота
ДГТ – дигидротестостерон
КП – карбоксипептидаза
КП M – карбоксипептидаза M
КП N – карбоксипептидаза N
КП U – карбоксипептидаза U
КП В – карбоксипептидаза В
КП Н – карбоксипептидаза Н
ЛГ – лютеинизирующий гормон
ПСА – простатический специфический антиген
ТРФ – тиреотропин-рилизинг-фактор
ФМСФ – фенилметилсульфонилфторид
ФМСФ-ингибируемая КП – фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза
ФСГ – фолликулостимулирующий гормон
ЭДТА – этилдиаминтетраацетат натрия
Половое развитие и дифференциация, а также процессы, связанные с размножением, представляют собой наиболее интересные проблемы современной биологии. Важную роль в этих процессах играют половые стероидные гормоны [23, 24, 27, 37, 39, 42, 43]. Синтез и секреция половых стероидов регулируется пептидными гормонами гипоталамуса (гонадотропин-рилизинг-фактор) и гипофиза (лютеинизирующий гормон и фолликулостимулирующий гормон) [24, 27, 37, 39, 42]. Кроме того, в регуляцию уровня половых стероидных гормонов вовлекаются многие нейропептиды, которые обычно не связывают с половой системой. Например, b-эндорфин [277], энкефалины [61], АКТГ [277], Arg8-вазопрессин [175, 214, 266], Arg8-вазотоцин [214] и др. Нейропептиды синтезируются в виде высокомолекулярных неактивных предшественников, в структуре которых аминокислотные последовательности активных пептидов ограничены парами остатков основных аминокислот [1, 65, 113, 120, 147]. Для высвобождения активных пептидов необходимо последовательное действие трипсиноподобного и карбоксипептидазо-В-подобного ферментов [113, 120, 152, 170]. К карбоксипептидазо-В-подобным относятся ферменты, отщепляющие остатки основных аминокислот с карбоксильного конца белка-предшественника. Именно эти ферменты участвуют на конечных стадиях процессинга и, вероятно, играют определенную роль в регуляции уровня активных пептидов [43, 120, 152, 170]. Известно, что карбоксипептидаза Н (КП Н, КФ 3.4.17.10) участвует в биосинтезе многих нейропептидов, таких как инсулин [6, 133, 253], глюкагон [46], энкефалины [46, 49], АКТГ [54], вазопрессин [57], окситоцин [58], вещество P [59], атриальный натрийуретический фактор [38]. Поскольку многие из этих пептидов принимают участие в регуляции уровня половых стероидных гормонов [24, 27, 39, 42], то возможно, что КП Н вовлекается в процессы половой дифференцировки и размножения, однако ее роль в этих процессах до конца не ясна. Вместе с тем предполагают, что функции недавно обнаруженной ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ-ингибируемой КП) сходны с таковыми КП Н. Однако роль этого фермента, практически, не изучена.
Целью данной работы было изучение активности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системе самцов и самок мышей при введении тестостерона и прогестерона. При выполнении работы были поставлены следующие задачи. 1. Сравнить распределение активности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП в отделах ГГНГС самцов и самок. 2. Изучить активность исследуемых карбоксипептидаз в динамике у самок при введении разных доз тестостерона и прогестерона. 3. Сравнить активность КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП у самцов и самок при введении тестостерона и прогестерона. 4. Изучить активность исследуемых ферментов in vitro при действии тестостерона и прогестерона.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучено влияние тестостерона и прогестерона на активность КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП в ГГНГС самцов и самок мышей. Установлена зависимость изменения активности исследуемых ферментов от пола животного и времени после введения стероидных гормонов. Полученные результаты представляют интерес для более глубокого понимания механизмов функционирования пептидергических систем и роли основных карбоксипептидаз в процессах, связанных с половыми стероидными гормонами.
Апробация и публикации. Материалы диссертации доложены на IV Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 1999 г.), на XXXVIII Международной студенческой конференции ”Студент и научно-технический прогресс” (Новосибирск, 2000 г.) и на итоговых научных конференциях ПГПУ (1998, 1999, 2000). По результатам исследования опубликовано 5 статей.
1.1. Нейропептиды и их обмен
Нейропептиды – это полифункциональные высокоактивные вещества пептидной природы, которые играют важную роль в реализации и регуляции различных физиологических и поведенческих реакций организма.
Нейропептиды играют важную роль в адаптационных процессах, проявляют анальгетические эффекты, участвуют в формировании пищедобывательного и полового поведения [26, 28, 30, 35, 140, 169, 207]. Многие из этих веществ вовлекаются в регуляцию полового созревания [2, 4, 38, 40]. Нейропептиды влияют на половую дифференциацию организма (ГнРФ, ЛГ, ФСГ, пролактин [24, 27, 39, 42, 43]), на процессы внимания и памяти (например, АКТГ и α-меланотропин - стимуляторы запоминания и внимания), на эмоциональное поведение (тиролиберин, меланостатин, кортиколиберин - стимуляторы эмоционального поведения), обладают анальгезирующим действием (нейротензин, опиодные пептиды) [34, 36].
Уровень нейропептидов определяется соотношением скоростей их синтеза и деградации.
Нейропептиды синтезируются в организме, как правило, в виде высокомолекулярных неактивных предшественников (препропептидов) [22]. В состав последних могут входить аминокислотная последовательность как одного, так и нескольких нейропептидов. Известно много белков, содержащих в своей структуре последовательности нейропептидов: предшественник гонадотропин-рилизинг-фактора, проопиомеланокортин, препроэнкефалин А, продинорфин (препроэнкефалин В) и другие [1, 32]. В частности, в состав предшественника гонадотропин-рилизинг-фактора входит ГнРФ и гонадолиберин-ассоциированный пептид.
Все препропептиды содержат на N-конце сигнальную последовательность из 15-20 остатков гидрофобных аминокислот. Нейропептиды, входящие в состав предшественника, как правило, ограничены с C- и N-концов (фланкированы) парами остатков основных аминокислот – аргинина и лизина [1, 3, 65, 81, 113, 120, 147].