Смекни!
smekni.com

Инструкция о мероприятиях по борьбе с лептоспирозом животных (стр. 7 из 7)

Сыворотку крови диких животных исследуют с лептоспирами 13–15 серогрупп.

В РМА используют эталонные штаммы лептоспир или их аналоги, рекомендованные Всесоюзным государственным научно-контрольным институтом ветеринарных препаратов МСХ СССР.

Диагностические штаммы лептоспир лаборатории получают во Всесоюзном государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов МСХ СССР, и поддерживают их периодическими пересевами через каждые 10 -15 дней.

Пригодность культуры для использования в реакции оценивают путем просмотра пробирок в проходящем свете и микроскопией.

При достаточном накоплении лептоспир после встряхивания пробирки с культурой в проходящем свете в среде хорошо заметны муаровые волны, а в спокойном состоянии легкая опалесценция. Наличие осадка, пленки, помутнения среды свидетельствует о прорастании культуры посторонней микрофлорой, полная прозрачность среды – об отсутствии лептоспир.

В реакции используют чистые культуры лептоспир в возрасте 5–15 дней без признаков агглютинации и лизиса (четкообразные, неподвижные клетки) с накоплением 70–100 микробных клеток в поле зрения микроскопа при увеличении 20X10X1,5 или 40X7–10. Культуры, содержащие 150–200 и более лептоспир в поле зрения микроскопа, разводят перед постановкой реакции питательной средой или физиологическим раствором до указанной концентрации.

Каждое разведение сыворотки разливают в отдельный ряд, состоящий из 5–13 лунок (пробирок) в зависимости от количества антигенов, используемых в реакции. Каждую культуру-антиген вносят по 0,1 мл в три лунки с разными разведениями сыворотки. После добавления антигенов пластины встряхивают и выдерживают в термостате при температуре 30 °С в течение часа.

Контролем служит смесь культуры лептоспир с физиологическим раствором по 0,1 мл. Лептоспиры в контроле должны оставаться подвижными, не иметь признаков лизиса и агглютинации.

4.1.8. Реакцию учитывают путем микроскопии капель из каждой лунки в темном поле микроскопа при увеличении 20X10 или 20X7X1,5. Капли из лунок выносят на предметное стекло бактериологической петлей от большего разведения к меньшему и просматривают их без покровного стекла. Капли можно наносить двумя способами: 1) бактериологической петлей диаметром 3 мм наносят на стекло сразу до 30 капель и затем просматривают их под микроскопом; 2) бактериологической петлей диаметром 1 мм наносят на предметное стекло в освещенный центр поля зрения одну каплю и просматривают ее, передвигают столик на 2–3 мм и рядом с первой наносят и учитывают вторую каплю. В этом случае на одном предметном стекле учитывают 60–80 капель.

После каждого антигена петлю прокаливают и охлаждают.

4.1.9. Результаты реакции оценивают в крестах по четырехбалльной системе:

+ + + +агглютинированы 100% лептоспир;

+ + + – агглютинированы 75% лептоспир;

+ + – – агглютинированы 50% лептоспир;

+ – – – агглютинированы 25% лептоспир;

– (знак минус) агглютинация отсутствует. Агглютинация проявляется в склеивании лептоспир и образовании паучков. Паучок включает от 3–5 до нескольких десятков и даже сотен лептоспир. Свободные концы лептоспир сохраняют подвижность.

В начальных разведениях сыворотки может наблюдаться лизис лептоопир, проявляющийся в набухании и обездвиживании, появлении зернистости и полного распада микробных клеток.

4.1.10. Положительной считают реакцию, оцененную не менее чем на два креста, при отсутствии агглютинации в 'контроле.

При повторном исследовании сыворотки крови реакцию ставят в тех же разведениях.

4.2. Порядок постановки и учета реакции макроагглютинации (РА)

Реакцию макроагглютинации ставят и учитывают в соответствии с Временным наставлением по применению антигенов для диагностики лептоспироза у животных реакцией макроагглютинации, утвержденным Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 12 мая 1974 года.

4.3. Оценка показаний РМА и РА

4.3.1. Животных с титром сыворотки в РМА 1: 100 или реагирующих по РА на 1–2 креста, кроме лошадей и крупного рогатого скота, реагирующих с лептоспирами группы Hebdomadis, считают подозреваемыми в заражении.

Крупный рогатый скот, реагирующий с лептоспирами группы Hebdomadis, и лошадей, реагирующих с лептоспирами любой серологической группы, считают подозреваемыми в заражении при титре антител в РМА 1: 500 или реагирующих в РА на 1–2 креста с неразведенной сывороткой.

Кровь от животных, подозреваемых в заражении, и от животных, не реагировавших при первом исследовании, повторно проверяют через 7–10 дней.

4.3.2. Выявление антител у животных, не реагировавших при первом исследовании, или нарастание титра у реагировавших в РМА в пять и более раз, или положительная РА на 3–4 креста свидетельствуют об активном инфекционном процессе у обследуемых животных.

4.3.3. Животных (кроме лошадей и реагирующего с лептоспирами группы Hebdomadis крупного рогатого скота) с титром сыворотки в РМА 1: 500 и более или в РА на 3–4 креста и крупный рогатый скот, реагирующий с лептоспирами группы Hebdomadis и лошадей, реагирующих с лептоспирами любой серогруппы при титре в РМА 1:2500 и более или в РА на 3–4 креста, рассматривают как возможных лептоспироносителей.

4.3.4. Возбудителями лептоспироза при серологической диагностике считают лептоспир той серологической группы, к которой обнаружены антитела в наиболее высоком титре.

Необходимо учитывать, что в сыворотке крови свиней, крупного рогатого и мелкого рогатого скота и лошадей при исследовании по РМА обнаруживают в 5 – 15% случаев (из числа положительно реагирующих) антитела в наиболее высоком титре к лептоспирам Australis, Autumnalis, Ballum, Pyrogenes, Cynoptery, Bataviae, которые не были выделены ни в одном случае от сельскохозяйственных животных.

Такие реакции следует рассматривать как межгрупповые, являющиеся следствием заражения животных лептоспирами Pomona, Tarassovi и другими, обычно выделяемыми от сельскохозяйственных животных.

Лептоспиры Australis, Bataviae, Autumnalis, Ballum, Pyrogenes, Cynoptery, Kazachstanica могут быть признаны возбудителями лептоспироза у сельскохозяйственных животных только после выделения этих лептоспир в чистой культуре или подтверждении их роли реакцией иммуноабсорбции.

4.4. Методика постановки реакции иммуноабсорбции при исследовании проб сыворотки

4.4.1. В реакции иммуноабсорбции изучают пробы сыворотки животных, агглютинирующие лептоспиры нескольких серологических групп в равно высоких титрах или имеющие наиболее высокий титр – по отношению к лептоспирам, ранее не известным в качестве возбудителя лептоспироза у сельскохозяйственных животных.

4.4.2. Для проведения абсорбции выращивают в 0,2 – 0,5 – литровых флаконах все штаммы лептоспир, с которыми данная проба сыворотки дала реакцию агглютинации. К 5–7-суточным культурам добавляют 0,3% формалина и выдерживают 10–12 часов. Затем лептоспиры осаждают центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 30 минут. Сливают надосадочную жидкость, а осадок суспензируют в объеме 0,9 мл среды или физиологического раствора, 0,1 мл исследуемой сыворотки смешивают с 0,9 мл концентрированного антигена и выдерживают в течение 48 часов при температуре 1–5 °С. Абсорбированную сыворотку проверяют в РМА на наличие остаточных антител к штамму-абсорбенту, а затем исследуют с лептоспирами групп, с которыми реагировала сыворотка до абсорбции.

4.4.3. В процессе абсорбции лептоспиры, являющиеся возбудителем инфекции у данной особи, извлекают из сыворотки антитела к лептоспирам всех других серологических групп, в то время как антитела к штамму-возбудителю болезни не абсорбируются из сыворотки гетерологичными типами лептоспир.

Для сокращения объема работы сыворотку можно в начале абсорбировать лептоспирами, являющимися наиболее частыми возбудителями болезни у животных данного вида.

4.4.4. Оценка эпизоотической ситуации в хозяйстве по результатам лабораторных исследований приведена в Инструкции о мероприятиях по борьбе с лептоспирозом животных пп. 2.4., 2.5. и 2.6.

Серологическая группа Серологический вариант Типовой штамм
Icterohae-morrhagiae icterohaemorrhagiae copenhageni mankarso naa'm mwogolo dakota sarmin birkini smithi ndambari ndahambukuje budapest weaveri RGA M-20 Mankarso Naam Mwogolo Grand River Sarmin Birkin Smith Ndambari Ndahambukuje PV-1 GZ-390-U
Javanica javanica poi sorex-jalna coxi sofia Veldrat Batavia 46 Poi Sorex Jalna Cox Sofia 874
Celledoni celledoni whitcombi Celledoni Whitcombi
Canicola canicola bafani kamituga jonsis sumneri broomi bindjei schnueffneri benjamin malaya Hond Utrecht IV Bafani Kamituga Jones Sumner Patane Bindjei Vleermuise 90-C Benjamin H-6
Ballum ballum castellonis arboreae MUS-127 Castellon-3 Arboreae
Pyrogenes pyrogenes Zanoni myocastoris abramis biggis hamptoni alexi robinsoni rnanilae Salinem Zanoni LSU-1551 Abraham Biggs Hampton HS-616 Robinson LT-398
Cynopteri cynopteri canalzoniae butembo 3522-C Cz-188k Butembo
Autumnalis autumnalis rachmati fortbragg sumatrana bulgarica bangkinang erinaceiauriti mooris sentot louisiana Orleans djasiman gurungi Akiyama A Rachmat Fort Bragg Sapulette Nikolaevo Bangkinang-1 Erinaceus auritus 670 Moores Sentot LSU-1945 LSU-2580 Djasiman Gurung
Australis australis lora muenchen jalna bratislava fugis bangkok peruviana pina nicaragua Ballico Lora Munchen C-90 Jalna Jez Bratislava Fudge Bangkok D-92 Lt-941 LT-932 Lt-990
Pomona pomona kennewieni monjakov mozdok tropika proechimys Pomona Lt-1026 Monjakov 5621 CZ-299U LT-796
Grippotypho-sa grippotyphosa valbuzzi Moskva-V Valbuzzi
Hebdomadis hebdomadis nona kambale kremastos worsfoldi jules maru borincana kabura mini Nebdomadis Nona Kambale Kremastos Worsfold Jules CZ-285– В HS-622 Kabura Sari
Hebdomadis szwajizak georgia perameles wolffihardjo recreo medanensis trinidad seiroe balcanica polonica nero haemolytica ricardi Szwajizak LT-117 Bandicoot-343 3705 Hardjoprajitno LT-957 Hond-HC LT-1098 M-84 1627 Burgas 493-Poland Qamsulin March Richardson
Bataviae bataviaepaidjan djatzi kobbe balboa claytoni brasiliensis Van Tienen Paidjan HS-26 CZ-320-K LT-761 LT-818 LT-996
Tarassovi tarassovi bakeri atlantae guidae kisuba bravo atchafalaya chagres rama gatuni Perepelicin LT-79 LT-81 RP-29 Kisuba Bravo LSU-1013 LT-924 LT-955 LT-839
Panama panama CZ-214-K
Sherman! shermani LT-821
Semaranga semaranga patoc sao-paulo Veldrat Semarang-173 Patoc I Sao Paulo
Andamana andamana CH-11