Существуют также методы для определения различных отдельных компонентов комплемента по их содержанию или функциональной активности. Это важное различие, так как компонент может присутствовать в нормальном количестве, но быть функционально неактивным. Содержание индивидуальных белков комплемента обычно определяют при помощи радиоиммуноанализа или ферментного иммуносорбентного анализа, используя антитела, специфичные к данному белку. Для измерения функциональной активности в суспензию сенсибилизированных эритроцитов вносят все компоненты комплемента, необходимые для лизиса, за исключением исследуемого белка.
ВЫДЕЛЕНИЕ ПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ
Для проведения многих иммунологических исследований in vivo и in vitro требуются те или иные популяции лимфоцитов. Их получают от экспериментальных животных, в основном из тимуса, селезенки и периферических лимфоузлов. Некоторые специальные исследования требуют выделения клеток из других участков организма, например из пейеровых бляшек. Рециркулирующие клетки можно получить путем канюлирования грудного лимфатического протока и сбора клеток в течение нескольких часов. У человека наиболее легко выделить лимфоциты периферической крови, а хирургическим путем можно получить также клетки селезенки, миндалин и лимфоузлов. Однако хирургически отобранный материал часто содержит инфекционные агенты или опухолевые клетки, в зависимости от заболевания, которое вызвало необходимость хирургического вмешательства. Следует иметь в виду, что клеточные популяции, содержащиеся в перечисленных тканях, совершенно различны как по степени зрелости лимфоцитов, так и по численному соотношению в них клеток разных типов.
Тимус является источником довольно чистой Т-клеточной популяции, однако составляющие ее лимфоциты различаются по степени зрелости. При работе с лимфоцитами из других органов и тканей часто возникает необходимость в выделении отдельных субпопуляций для анализа их особых функций. Применение с этой целью описанного выше проточного флуоресцентного клеточного сортера, позволяющего разделять лимфоциты по их поверхностным маркерам, позволяет получать лишь ограниченное число клеток, поскольку скорость цитометрии с сортировкой весьма низка. Существует, однако, и ряд методов, позволяющих выделять лимфоциты и их отдельные субпопуляции сразу из всего объема исследуемого образца, — центрифугирование в градиенте плотности, розеткообразование, пэннинг и магнитное разделение.
Выделение в градиенте плотности основано на том, что лимфоциты имеют меньшую плотность, чем эритроциты и гранулоциты. Этот способ позволяет выделять большую часть лимфоцитов крови. Розеткообразование и пэннинг используют для выделения субпопуляций. Пэннинг представляет собой разновидность аффинной хроматографии применительно к лимфоцитам. На сходном принципе основан и способ разделения с помощью магнитных гранул, покрытых специфическими антителами. При смешивании с клетками гранулы связывают те из них, которые распознаются фиксированными антителами. Эти клетки можно затем смыть с гранул или выделить путем наложения магнитного поля.
Другой способ — он применяется для удаления ненужной клеточной популяции, — основан на использовании антител и комплемента. Если к смеси клеток добавить специфические антитела, а затем комплемент, клетки соответствующей субпопуляции будут лизированы. Конечно, для этого метода пригодны лишь такие антитела, которые связывают комплемент; кроме того, клетки-мишени должны нести на поверхности достаточное количество молекул антигена, чтобы фиксировать литическую дозу комплемента.
Источником определенных популяций лимфоцитов могут служить антигенспецифичные Т-клеточные линии, культивируемые в течение длительного периода. Получение таких линий позволяет обойтись без частого выделения первичных культур из органов и тканей животных.
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТОРНЫХ КЛЕТОК
Разработаны различные методы для определения эффекторных функций лимфоцитов, в частности продукции антител, цитотоксичности и опосредованной Т-клетками помощи и супрессии.
В-клетки, продуцирующие IgM- или IgG-антитела, можно определить при помощи метода локального гемолиза, или реакции бляшкообразования. Другим способом выявления антителообразующих клеток служит иммуноферментный тест ELISPOT. Он позволяет определять функционально активные Т-клетки, секретируюшие те или иные растворимые медиаторы, т. е. цитокины. Определение проводят на подложке с иммобилизованными антителами к специфическому цитокину. Эти антитела связывают данный цитокин, выделяемый Т-клеткой в окружающую зону, и эффект связывания можно выявить путем соответствующей обработки подложки: вокруг цитокинвыделяющих Т-клеток будут видны окрашенные пятнышки.
Для определения антигенспецифичных Т-клеток часто используют тест стимуляции лимфоцитов — пролиферативный ответ Т-клеток на антиген, выявляемый по включению ими 3Н-тимидина. Цитотоксическую активность клеточных популяций обычно определяют по их способности лизировать клетки-мишени. Количественно лизис клеток-мишеней определяют при помощи теста с высвобождением меченого хрома.
Миграция лимфоцитов
В экспериментах по изучению миграции лимфоцитов in vivo обычно исследуют распределение в тех или иных тканях введенных внутривенно мелекул адгезии, метят лимфоциты или эндотелиальные клетки и используют блокирующие адгезию антитела для иммунопреципитации специфических молекул адгезии.
ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ И НАПРАВЛЕННАЯ ДОСТАВКА ГЕНОВ
Трансгенные животные
Один из путей для изучения функций той или иной молекулы — это создание трансгенных животных, у которых ген данной молекулы либо делетирован, либо экспрессируется, но на сверхвысоком уровне или с образованием измененного продукта. Оригинальный способ получения трансгенных животных состоит в инъекции примерно ста копий данного гена непосредственно в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйцеклетку переносят затем в яйцевод ложнобеременной мыши-самки, в матке которой и развивается эмбрион. Потомство таких мышей отличается вариабельностью. У небольшого числа эмбрионов одна или больше копий гена встраивается в одну из хромосом до первого клеточного деления. Эти животные являются гетерозиготами по трансгену. У другой части животных включение трансгена происходит после первого деления, и мыши оказываются химерами, у которых наряду с нормальными клетками имеются клетки, содержащие трансген. У большинства мышей трансген не встраивается в хромосому. Статус каждой мыши определяют путем исследования образцов клеток на присутствие гена, для чего применяют саузернблоттинг. На основании данных анализа отбирают трансгенных гетерозиготных животных, которых затем используют для скрещивания и получения гомозиготной трансгенной линии.
Обычно включение трансгенов в хромосому происходит случайным образом и в виде блока из нескольких копий. Важно, что при включении трансгенного блока не образуется разрывов в других, функционально важных генах. Характер экспрессии трансгенов зависит от ряда факторов. Иногда эти гены оказываются под контролем промоторов общего типа и экспрессируются в большинстве тканей. В других случаях они связаны с тканеспецифическими промоторами и их экспрессия ограничена лишь некоторыми тканями и клетками или определенными стадиями развития. К интерпретации фенотипа трансгенных животных необходимо подходить с осторожностью, поскольку высокую экспрессию трансгенов в несоответствующих тканях нельзя считать физиологичной.
Направленная доставка гена
Этот более тонкий метод на первом этапе состоит в переносе гена, который взаимодействует или рекомбинирует с исследуемым эндогенным геном и вызывает в результате его изменение. Например, в этом эндогенном гене может произойти делеция, в нем могут возникнуть точковые мутации или выпасть экзон. Такой измененный ген вводят в эмбриональную полипотентную стволовую клетку, где он рекомбинирует с аналогичным эндогенным геном. Эту стволовую клетку переносят затем в бластоцисту или имплантируют описанным выше способом.