В стерильные стеклянные колбы - отстойники грушевидной формы с герметично закрывающимися верхним и нижним отводами, емкостью не ниже 5 л заливают 2 л стабилизирующего раствора следующего состава: апирогенная дистиллированная вода - I л, глюкоза фармацевтическая - 20 г, аскорбиновая кислота - 0,25 г, хлористый кальций - 5 г, цитрат натрия трехзамещенный - 15 г. Стабилизирующий раствор при 20°С должен иметь плотность 1,05 г/мл. Раствор стерилизуется автоклавированием или фильтрацией и может храниться продолжительное время при температуре 4°С. Однако, концентрированный раствор цитрата натрия целесообразно автоклавировать отдельно и вводить непосредственно в отстойник.
В отстойник со стабилизирующим раствором вводят равный (2л) объем клеточной фракции. Суспензию тщательно перемешивают и добавляют раствор осадителя эритроцитов в количестве 1/10 от суммарного объема суспензии (около 400 мл).
В качестве осадителей используют декстран фармацевтический с молекулярной массой не ниже 80 000 Дальтон (исходный раствор 100г/л), поливиниловый спирт фармацевтический (исходный раствор 50 г/л или смесь 1:1 по объему). Растворы осадителей стерилизуют автоклавированием или фильтрацией и могут храниться продолжительное время при температуре +4°С,
Под действие осадителей происходит агрегация эритроцитов, что ускоряет их выпадение из суспензии, В результате происходит расслоение суспензии на 2 фракции - темно-окрашенную нижнюю (фракция эритроцитов) и светлую верхнюю (фракция лейкоцитов). Через нижний отвод отстойника фракцию эритроцитов сливают. Затем сливают и фракцию лейкоцитов. Клетки отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок клеток ресуспедируют в питательной среде с конечной концентрацией 0,5% этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА).
Операция 2. Гемолиз остаточных эритроцитов.
Для гемолиза используют 0,83%-ный раствор хлористого аммония в апирогенной дистиллированной воде, охлажденной до 4°С. Раствор стерилизируют автоклавированием. Клеточную суспензию заливают не менее чем 10 объемами гемолитика, выдерживают в течение 10 мин при 4°С, в затем клетки отделяют центрифугированием (600*Д, 10 мин, 4°С).
Надосадочную жидкость сливают и не используют на последующих стадиях. Осадок клеток суспендируют в питательной среде 199 или минимальной "игла", содержащей 3 ед/мл гепарина, 5% донорской плазмы или сыворотки, 0,1 трилона Б и 5 ед/мл мономицина, среда № I.
Операция 3. Подсчет жизнеспособных лейкоцитов.
Для определения количества жизнеспособных клеток используют 1%-ный водный раствор эозината натрия. Эозинатом, окрашиваются в красный цвет только погибшие клетки.
Отбирают 0,5 мл тщательно перемененной суспензии и объединяют ее с 0,5 мл раствора эозината. Выдерживают смесь 30 сек при комнатной температуре и разводят физраствором в 100 раз. Разведение вводят в счетную камеру Горяева и считают количество окрашенных и неокрашенных клеток под микроскопом с увеличением 100 во всей камере, количество жизнеспособных клеток (X) определяют по формуле:
X = А х 200 х 1100, где
А - количество неокрашенных клеток в камере.
Количество нежизнеспособных (окрашенных клеток) не должно превышать 3% от общего числа клеток в суспензии.
Стадия 2. Стимуляция интерфероногенеза - прайминг.
На этой стадии преследуют 2 основных цели; активизировать метаболизм лейкоцита (для этого в культуральную среду вводят нативную плазму и инсулин) и стимулировать интерфероногенез действием интерферона. При правильной постановке прайминг обеспечивает повышение выхода активности не менее, чем в 4 раза.
Операция 4. Составление культуральной среды.
Лейкоциты, освобожденные от примеси эритроцитов, суспендируют из расчета 10-20 млн клеток в I мл среды №1, в которую добавлены 0,0015 ед/мл инсулина и 100-200 ед/мл нативного интерферона. Суспензию переливают в плоскодонные колбы емкостью 5 л, заполняя только половину объема. В колбу помещают стержень из мягкого железа с некоррозирующим покрытием, который предварительно стерилизуют автоклавированием или прожиганием в пламени горелки.
Операция 5. Суспензионное культивирование.
Колбы с клеточной взвесью перекрывают стерильной алюминиевой фольгой и помещают в водяную баню из магнитно-проводящего материала (пластика любого типа или оргстекла), подключенную к ультратермостату. Ультратермостат должен обеспечивать устойчивое поддержания температуры в клеточной взвеси в пределах 37,5°С. Под баней помешают магнитные мешалки, вращение которых передается стержню в культуральной колбе. При скорости вращения 100 об/мин лейкоциты не травмируются, но устойчиво поддерживаются в суспензии.
Клетки инкубируют неменее 2-х часов (биологическое время). Если возникает необходимость, продолжительность прайминга можноувеличить до 12- часов. Однако в этом случат в культуральную среду необходимодобавить 0,005 М сукцината натрия.
Стадия 3. Индукция интерферона.
Для индукции используют бактериологический стерильный вирус болезни Ньюкасла с инфекционным титром не ниже 108/мл ТЦД50 в культуре куриных фибробластов. Вирус предварительно подогревают по 37,5°С.
Операция 6. Введение вируса-интерфероногена.
Культуральные колбы вскрывают под пламенем горелки и вирусосодержащую аллантоисную жидкость переливают в суспензию из расчета 10-100 ТЦД50 на I лейкоцит. Так, при содержании лейкоцитов 25 млрд. добавляют 250 млн вируса с интерфероногеным титром 109 ТЦД50. Колбу перекрывают алюминиевой фольгой с соблюдением условий стерильности и инкубируют в течение I часа при 37,5°С.
Стадия 4. Отделение индуцированных лейкоцитов.
На стадии индукции завершают подготовительные этапы интерфероногенеза.
Для улучшения переносимости препарата, после индукции необходимо удаление культуральной жидкости неадсорбировавшихся частиц вируса-индуктора и антигенов куриной аллантоисной жидкости. Для этих целей оказалось целесообразным отделение индуцированных лейкоцитов и переведение их в среду нового состава.
Операция 7. Отделение индуцированных лейкоцитов.
Суспензию индуцированных лейкоцитов центрифугируют при 600хД 15 мин 4°С, или сепарируют в условиях стерильности. Надосадочную жидкость отбирают в отдельную емкость для обеззараживания, а осадок клеток суспендируют в питательной среде следующего состава: среда № 199 или минимальная "Игла", 3 ед/мг гепарина, 5% плазмы или сыворотки донорской крови, мономицин 50 ед/мл, рН 7,2-7,4 /среда №2/.
Стадия 5. Биосинтез
Биосинтез интерферона проводят в стационарной культуре лейкоцитов. При этом происходит весьма прочное прикрепление лейкоцитов к поверхности культурного сосуда. Оказалось, что важнейшим параметром, определявшим выход активности, при стационарном культивировании является плотность посадки, то есть количество клеток на единицу поверхности. Экспериментально установлено, что оптимальным для интерфероногенеза является плотность в 5-7 млн лейкоцитов на I см поверхности. Показательно, что при такой плотности посадки лейкоциты создают пласт толщиной в 3 клетки. Хорошему прикреплению клеток способствует нанесение на внутренние поверхности культурального сосуда гидрофобного покрытия - силикона любой марки.
Для обеспечения питательной потребности культуры совершенно достаточно 0,1 л среды №2 на I млн лейкоцитов. Основой энергетического обмена для лейкоцитов является анаэробный гликолиз. Из-за дефектности ферментных систем начальных стадий цикла Кребса, окисление глюкозы в этих клетках завершается на стадии лактата и лишь небольшое количество (в пределах 3%) подвергается дальнейшему расщеплению. Поэтому, объем воздушной фазы в культуральном сосуде мало влияет на выход активности. Однако, заполнение средой культурального сосуда, более чем на половину его объема не рекомендуется.
Указанные выше рекомендации следует использовать при составлении клеточной взвеси в конкретных условиях.
Для каждого типа культурального сосуда необходимо подобрать оптимальные соотношения количества клеток и среды №2 (сохранив и газовую фазу), учитывая выходы активности и экономичность процесса биосинтеза.
Операция 8. Стационарное культивирование индуцированных лейкоцитов.
В матрицы, со строгим соблюдением стерильности, заливают рассчитанное количество среды №2 и вводят необходимое количество лейкоцитов. Перекрывают матрицы стерильными пробками, суспензию клеток тщательно перемешивают и устанавливают матрицы в соответствующе положение (норма "ребро") на стеллажи термального помещения с температурой 37°С. Культивирование продолжают 18-20 часов. Допускается роллерное культивирование лейкоцитов на стации биосинтеза при соблюдении вышеуказанных принципов.
Операция 9. Отделение отработанных лейкоцитов.
После завершения синтеза интерферон-содержащую культуральную среду подвергают центрифугированию или сепарированию с соблюдением условий стерильности для отделения отработанных клеток.
Надосадочную жидкость собирают в стерильные бутыли емкостью –10 л. Затем, для инактивации вируса - интерфероногена в каждой бутыли доводят величину рН до 2,5 добавлением притщательном перемешивании (пипеткой, постепенно) 20%-ного раствора соляной кислоты. Правильность доведения величины рН необходимо контролировать с помощью потенциометра любой системы. Из каждом бутыли отбирают образец (10 мл) для проведения контролей, после чего бутыль перекрывают стерильной резиновой пробкой и запечатывают, на бутыль приклеивают этикетку с указанием номера серии и даты изготовления. Перед розливом по ампулам доводят рН раствора до 7,0-6,5.
Операция 10. Розлив и лиофильная сушка.
В ампулы и флаконы емкостью 5-10 мл препарат разливают по 2 мл. Во флаконы емкостью 500 мл по 50 мл.
Препарат вводят мерно с помощью дозатора или бюретки со строгим соблюдением условий стерильности. Ампулы или флаконы с препаратом перекрывают стерильными марлевыми (2 слоя) тампонами и устанавливают вертикально в кассеты сушильного аппарата. Кассеты с препаратом подвергают замораживанию при З6-40°С в течение 48-72 часов,