Подкожную маллеиновую пробу применяют не ранее 1,5 мес. после предыдущей подкожной пробы. Перед ее проведением животных выдерживают на привязи не менее суток и поят подогретой водой. У лошадей (ослов, мулов) измеряют температуру тела в 7-8, 14-15 и 21-22 ч.
Обследование животных с кратковременным или длительным повышением температуры до 39 гр.С и выше подкожной маллеиновой пробой не проводят. Маллеин животным вводят подкожно в области подгрудка в количестве 1 куб.см. Общую температурную реакцию тела и местную реакцию в области введения аллергена учитывают через 6-8, 10-12, 14-16, 20-24 и 30-36 ч. Положительная реакция характеризуется постепенным подъемом температуры до 39,6 гр.С и выше и медленным ее спадом с возможным слабым вторичным подъемом через 30-36 часов, а также образованием в месте введения маллеина воспалительной припухлости разной степени выраженности. Реакцию считают отрицательной при нормальной температуре тела или кратковременном подъеме ее не более 39,5 гр.С и отсутствии изменений в месте введения маллеина.
Серологическое исследование.
Пластинчатая реакция агглютинации с сапным цветным антигеном (РА).
Антиген сапной цветной для пластинчатой РА представляет собой гомогенную взвесь в буферном растворе инактивированной окрашенной культуры возбудителя сапа. При хранении допускается образование осадка, переходящего в гомогенную взвесь при встряхивании. Перед употреблении флакон с антигеном выдерживают в течение 15-20 мин. при температуре (18-30)гр.С и встряхивают. Испытуемая сыворотка крови лошадей, нативная или консервированная. Консервирование сыворотки крови проводят кристаллами борной кислоты (2-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора или путем однократного замораживания.
Не консервированная сыворотка крови пригодна для исследования в течение 5 суток со дня взятия крови с сохранением ее при температуре (4-8)гр.С. Сыворотка, консервированная борной кислотой, пригодна для исследования в течение 10 суток, замороженная сыворотка - в течение 3 суток после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки крови исследованию на сап не подлежат.
Сыворотка сапная для РА и РСК (позитивная сыворотка), изготавливается на биопредприятии. Сыворотка крови лошадей неспецифическая не консервированная (неготивная сыворотка), изготавливается на биопредприятии. Физиологический раствор - 0,85%-ный раствор хлорида натрия рН 6,8-7,2.
Коррекцию рН проводят 10%-ным раствором соляной кислоты или 10%-ным раствором гидроокиси натрия.
Постановка РА.
Реакцию проводят на чистых сухих металлических эмалированных пластинках с лунками при температуре (18-30)гр.С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер исследуемой сапной крови.
В начале работы ставят контроль антигена с позитивный сапной сывороткой и с негативной сывороткой крови лошадей, а также контроль антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 куб.см антигена добавляют 0,03 куб.см сыворотки или физиологического раствора). Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 куб.см вносят на дно лунки при помощи шприца-полуавтомата или микропипетки. После внесения каждой сыворотки шприц-полуавтомат (микропипетку) трижды промывают физиологическим раствором и подсушивают фильтровальной бумагой. В каждую лунку рядом с сывороткой при помощи шприца-полуавтомата или микропипетки вносят 0,03 куб.см антигена. Затем антиген в каждой лунке тщательно смешивают с сывороткой ручным смесителем до получения однородной смеси, распределяя ее по всей поверхности лунки.
Пластинку с сыворотками с антигеном покачивают в течение 4 мин. осторожными вращательными движениями вручную или при помощи аппарата для покачивания диагностических пластинок. Учет результатов реакции проводят визуально через 4 мин. после смешивания сыворотки крови с антигеном при слегка наклонном положении пластинки. Реакцию считают положительной при наличии отчетливо выраженной агглютинации окрашенных сапных бактерий антигена в виде мелких или крупных хлопьев при частичном или полном просветлении жидкости. Реакцию считают отрицательной при отсутствии четкой агглютинации. Агглютинацию, которая возникает позже 4 мин., не учитывают. После учета реакции пластинки и смеситель дезинфицируют погружением их на 5 мин. в 1%-ный раствор хлорамина, затем моют водопроводной водой , ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и используют повторно. Для проведения дезинфекции и сушки пластинок используют кассеты и штативы-сушилки.
Реакция связывания комплемента.
Физиологический раствор. 2,5%-ная взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе. Кровь у барана берут утром, до кормления, из яремной вены во флакон со стеклянными или металлическими бусами, встряхивают в течение 7-10 мин. и затем фильтруют через марлю. Эритроциты 3-4 раза отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500-3000 об./мин. до полного обесцвечивания промывной жидкости. Из осадка эритроцитов готовят 2.5%-ную взвесь в физиологическом растворе.
Затем по 0,2 куб.см каждого разведения переносят в ряд пробирок, в каждую пробирку добавляют по 0,2 куб.см комплемента в разведении 1:20, 0,2 куб см 2,5 %-ной взвеси эритроцитов и 0,4 куб.см физиологического раствора. Штатив с пробирками встряхивают и помещают в водяную баню на 10 мин. при температуре (37-38)гр.С. Титром гемолизина считают наибольшее его разведение, при котором наблюдается полный гемолиз эритроцитами.
Приготовление гемолитической системы.
Гемолитическую систему готовят смешиванием в равных объемах 2,5%-ной взвеси эритроцитов барана в физиологическом растворе и раствора гемолитической сыворотки, взятой у удвоенном титре (например, пр титре гемолизина 1:1000 берут 2:1000, то есть для приготовления 10 куб.см гемолизина берут 0,2 куб.см гемолизина из ампулы и разводят в 99,8 куб см физиологического раствора).
Полученные 100 куб.см раствора гемолизина приливают при постоянном помешивании к 100 куб.см взвеси эритроцитов. Гемолитическую систему помещают в водяную баню при температуре (37-38)гр.С на 20 мин. для сенсибилизации эритроцитов.
Титрование комплемента проводят перед каждой постановкой реакции. Отбирают необходимое для данного объема исследований количество ампул (флаконов) с комплементом (из расчета 1 ампула или флакон на 100 пробирок реакции), растворяют препарат в физиологическом растворе, количество которого указано на ампуле (флаконе), сливают в одну емкость и перемешивают. Таким образом получают основной раствор комплемента, который хранят в холодильнике на протяжении постановки реакции. Из этого раствора готовят разведение 1:20 для титрования.
Комплемент титруют в бактериолитической системе, для чего позитивную, негативную и 1-2 сыворотки из опыта разводят физиологическим раствором 1:10, инактивируют при температуре (60 62)гр.С в течение 30 мин. и разливают по 0,2 куб.см каждую в два ряда пробирок.
Внесение остальных ингредиентов и условия титрования показаны в табл.1 на примере негативной сыворотки, при этом во вторые ряды сывороток вместо антигена вносят 0,2 куб.см физиологического раствора.
При работе с аппаратом Флоринского для разведения комплемента берут дополнительный ряд пробирок, в которых делают те же разведения комплемента, но объем увеличивают в 10 раз, Затем разливателем Флоринского переносят по 0,2 куб.см разведенного комплемента во все пробирки каждого ряда и вносят остальные ингредиенты.
Титром комплемента в бактериолитической системе считают минимальное количество его, необходимое для полного гемолиза эритроцитов барана в пробирках с негативной сывороткой и сыворотками из опыта с антигеном и без антигена, а также в пробирках с сапной сывороткой без антигена при полной задержке гемолиза в пробирках с сапной сывороткой и антигеном.
Каждую сыворотку крови предварительно проинактивированную, как указано в п.3.2.4., исследуют в трех пробирках: без антигена в разведении 1:5 (контроль сыворотки) и с антигеном в разведении 1:5 и 1:10.
Для этого в первую и третью пробирки разливают физиологический раствор в количестве 0,4 куб.см и 0,1 куб.см соответственно. Затем в первую вносят 01 куб.см испытуемой сыворотки, смешивают и переносят 0,2 куб.см во вторую и 0,1 куб.см - в третью пробирки.
В опытные пробирки вносят по 0,2 куб.см сапного антигена в рабочем разведении в контрольные - по 0,2 куб.см комплемента в установленном титре. Штативы встряхивают и помещают в водяную баню на 20 мин. при температуре (37-38)гр.С.
Затем во все пробирки вносят по 0,4 куб.см гемолитической системы, встряхивают и вновь помещают в водяную баню на 20 мин. при температуре (37-38)гр.С.
Одновременно ставят следующие контроли:
Позитивная и негативная сыворотки в тех же разведениях, что и испытуемые с антигеном и без антигена;
антиген без сыворотки (на антикомплементарность); антиген без сыворотки и комплемента (на гомотоксичность); гемсистема с физраствором.
При массовых исследованиях допускается постановка реакции в одной пробирке с разведением сыворотки 1:10 (0,02 куб.см сыворотки и 0,18 куб.см физиологического раствора). При работе с аппаратом Флоринского к 0,02 куб.см сыворотки добавляют 0,2 куб.см физиологического раствора. Сыворотки с задержкой гемолиза исследуют повторно, как указано выше.
Учет результатов реакции проводят дважды: непосредственно после последнего прогревания пробирок в водяной бане и на следующие сутки после хранения пробирок при температуре (4-8)гр.С.
Сначала учитываются результаты контролей. Если в пробирках с позитивной сывороткой и антигеном, с антигеном без сыворотки и комплемента, с гемолитической системой и физиологическим раствором будет полная задержка гемолиза, а в пробирках с негативной сывороткой и антигеном, с сапной и негативной сыворотками без антигена и с антигеном без сыворотки - полный гемолиз, постановку реакции считают правильной и проводят учет результатов.
Реакцию учитывают по степени задержки гемолиза эритроцитов, которую определяют по шкале, приготовленной перед учетом реакции. Для этого содержимое трех-пяти пробирок с полным гемолизом сливают в одну, затем гемолизированную жидкость и физиологический раствор разливают в пробирки по схеме. Реакцию оценивают в крестах в зависимости от процента гемолизированных эритроцитов: