ТЕМА №4. РЕГУЛЯЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ БРОДИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДСТВ
4.1 УГЛЕВОДНЫЙ ОБМЕН ДРОЖЖЕЙ
Потребление углеводов клеткой дрожжей
Порядок потребления углеводов:
Дрожжи как основной компонент брожения определяют его течение. Для них характерно последовательное потребление и сбраживание углеводов муки.
Первыми усваиваются те сахара, которые обеспечивают максимальную скорость роста: глюкоза→сахароза→фруктоза→мальтоза→мелитриоза.
1. Глюкоза и сахароза потребляются быстрее, т.к. ферменты, ответственные за их транспорт и сбраживание (пермеазы, β-фруктофуранозидаза, фосфатаза), являются конститутивными. Это ферменты так называемого зимазного комплекса дрожжей, отличающегося высокой активностью.
Глюкоза первой легко проникает в клетку. Перенос ее осуществляется за счет пассивной диффузии и активного транспорта с помощью ферментов-пермеаз. В клетке глюкоза фосфорилируется с участием фермента фосфатазы и далее участвует в процессе спиртового брожения.
Сахароза предварительно расщепляется на глюкозу и фруктозу экзоферментом β-фруктофуранозидазой (инвертазой), поэтому ее усвоение идет медленнее глюкозы.
2. Фруктоза сначала изомеризуется вне клетки в глюкозу с помощью фермента фруктоизомеразы, и только потом проникает внутрь.
3. Мальтоза и мелитриоза проникают внутрь клетки с помощью мальтопермеазы, где расщепляются эндоферментами мальтазой (a-глюкозидазой) и α-галактозидазой на составляющие их моносахариды.
Более позднее потребление фруктозы, мальтозы, мелитриозы объясняется тем, что ферменты, отвечающие за их транспорт и усвоение, являются индуцибельными. Т.е., во-первых, нужно время для их синтеза, во-вторых, достаточное количество вокруг клетки данных сахаров. Кроме того, ни фруктоизомераза, ни мальтопермеаза, ни мальтаза, ни a-глюкозидаза не синтезируются клеткой, пока в среде не останется менее 0,4% глюкозы. Поэтому говорят, что они катаболически репрессированы. Т.е. это и есть явление «глюкозной репрессии». Так, усвоение мальтозы начинается при концентрации глюкозы не>0,2-0,75%, а усвоение мелитриозы при концентрации мальтозы не>1,2-3,9 %.
Глюкоза, фруктоза, сахароза (при условии, что они находятся в низких концентрациях) полностью усваиваются за 24 ч, мальтоза за 70-72 ч, мелитриоза>72 ч.
Практическая значимость такого порядка усвоения углеводов клеткой:
1. Если засевные дрожжи используют в оптимальном физиологическом состоянии, то при внесении в сусло они готовы утилизировать все сбраживаемые сахара немедленно. Но все равно скорость потребления мальтозы+мальтотриозы снизится и такой останется, пока концентрация глюкозы не достигнет 0,4%.
Особенно это ярко выражено при добавлении в сусло глюкозных (пиво) или сахарных сиропов, инвертных сиропов. Или при длительном наполнении ЦКТ суслом при постоянной подаче глюкозы и фруктозы и дифференцированной дозировке дрожжей.
2. Если засевные дрожжи хранят в течение длительного времени в отсутствии индуцибельной концентрации мальтозы или в условиях ограниченного синтеза белка (например, отсутствует ассимилируемый азот), то у них перестает образовываться фермент мальтопермеаза. Тогда при использовании таких дрожжей удлиняется период брожения на время, необходимое клетке для синтеза необходимых ферментов.
Однако такие условия хранения не играют роли для штаммов, у которых отстает глюкозная репрессия (пивная раса 11).
3. Сильнофлокулирующие дрожжи сбраживают мелитриозу слабее, чем слабофлокулирующие.
4. Только для пивоварения: если использовать штаммы, легко сбраживающие мелитриозу, то можно получить пиво с меньшим содержанием экстракта. Если использовать штаммы, не сбраживающие мелитриозу, то можно получить пиво, богатое трисахаридами, т.е. с более полным вкусом.
5. Только для спиртового производства: дрожжи, легко сбраживающие мелитриозу, производят больше спирта.
Превращения углеводов в клетке дрожжей
Спиртовое брожение (локализация в клетке, схема, значение) см. «Микробиологию».
Дыхание (локализация в клетке, схема, значение) см. «Микробиологию».
Практическое значение спиртового брожения:
1. Сушеные дрожжи (пивные и винные) обнаруживают дополнительную форму брожения: глюкоза → ПВК + глицерин. Это происходит, если в среду добавить бисульфит Na.
2. Если создать щелочную рН (т.е. выше нормы 3-6), то будут образовываться уксусная кислота и этанол.
Практическое значение дыхания:
1. При дыхании дрожжи потребляет меньше субстрата, но при этом образуется больше биомассы.
2. Процесс дыхания выгоден и используется в основном для дрожжевого производства.
Синтез углеводов в клетке
ТРЕГАЛОЗА
Местонахождение трегалозы: она располагается в цитоплазме, частично связанна с клеточной стенкой. В бродящих дрожжах ее содержится около 6%, в дышащих до 18%).
Роль трегалозы:
1. поддержание структуры цитозоля;
2. осмотический барьер;
3. защита клеточной стенки от внешнего воздействия;
4. в лаг-фазе повышает устойчивость клетки к стрессам. Даже при наличии в среде всех необходимых субстратов первой клетка расходует свою накопленную трегалозу (первые 45 мин), только потом усваивается глюкоза из среды;
5. отвечает за ксерорезистентность клетки (хлебопекарные, пивные, винные дрожжи).
Синтез трегалозы усиливается при:
при избытке кислорода,
при переходе из логарифмической фазы в стационарную,
при повышении температуры до 35оС и выше, оптимум синтеза при 45оС.
ГЛИКОГЕН
Синтез и расход гликогена:
Гликоген находится в виде скоплений в цитоплазме, вакуолях.
0,25% потребленной мальтозы дрожжи запасают в виде гликогена, остальная часть гликогена образуется в результате всего обмена веществ.
Часть накопленного гликогена тратится перед началом брожения (при адаптации), затем его количество снижается в первые 10-12 часов, и потом вновь возрастает, пока его количество не будет составлять до 30% от массы клетки.
Также он тратится клеткой при хранении дрожжей, особенно при длительном хранении и высокой температуре хранения.
Практическое значение:
Дрожжи лучше хранить недолгое время при низкой температуре, иначе количество гликогена в них понизится. А чем меньше в засевных дрожжах гликогена, тем хуже они адаптируются, у них меньше выход биомассы, в среде образуется при брожении много диацетила, уксусного альдегида, SO2.
4.2. АЗОТНЫЙ ОБМЕН ДРОЖЖЕЙ
От азотного обмена зависит построение компонентов клетки дрожжей и образование в готовом продукте ароматических веществ.
Потребление источников азота клеткой дрожжей
В качестве источников N дрожжи используют аммиак, соли аммония, мочевину, аминокислоты, амиды, пептиды, пуриновые и пиримидиновые основания. Азотсодержащие вещества потребляются клеткой в процессе брожения и роста. Более быстрый рост дрожжей наблюдается в среде «соли аммония+аминокислоты», чем только аминокислоты или только аммоний. Но аминокислоты нужнее клетке, т.к. используются для синтеза других аминокислот и белков клетки.
Аминокислоты усваиваются в определенной последовательности в зависимости от наличия специфических пермеаз. По скорости усвоения они % на 4 группы:
· Быстроабсорбирующиеся (в первые 20 ч брожения): глутаминовая и аспарагиновая кислоты, аспарагин, глутамин, серин, треонин, лизин, аргинин.
· Средний уровень абсорбции (в процессе всего брожения): валин, метионин, лейцин, изолейцин, гистидин.
· Низкий уровень абсорбции: глицин, фенилаланин, тирозин, триптофан, аланин.
· Совсем мало абсорбируются: пролин (причем его много в пивном сусле).
Наиболее полно используются метионин, серин, глутаминовая кислота, цистеин, лизин, гистидин.
Если в среде нет разветвленных аминокислот и клетка вынуждена синтезировать их самостоятельно, то это приводит к накоплению диацетила и 2,3-пентадиона.
Превращения азотсодержащих веществ в клетке дрожжей
Для роста (дыхания) содержание аминокислот д.б. не более 100 мг/л; для брожения 150-200 мг/л.
В клетке система трансаминаз удаляет из молекулы аминокислоты NH2, а углеродный остаток направляется в оксокислотный пул (кетокислотный). Кроме них, в этом пуле есть уже синтезированные дрожжами углеродные цепочки; аминокислоты; нуклеотиды, NH2. Это резерв клетки. Отсюда новые аминокислоты идут на синтез белка в рибосомы. Если в среде нет азота, то новые аминокислоты черпаются из пула. Задача нормального питания – поддерживать этот резерв. Полная смесь аминокислот восстанавливает пул целиком, а аммоний+отдельные аминокислоты – частично.
Если в среде отсутствуют необходимые аминокислоты, то часть имеющихся дезаминируется/трансаминируется. Образующийся при этом NH4 используется для синтеза недостающих аминокислот. Оба процесса идут медленнее, чем прямое потребление аминокислот.
Практическое значение потребления и превращения азотсодержащих веществ:
1. Сложная смесь аминокислот+аммоний обеспечивает более быстрый рост, чем только аммоний, или только одни аминокислоты (сложная/простая смесь).
2. Рост дрожжей задерживается тем сильнее, чем больше необходимых аминокислот отсутствует в среде.
3. Если используется несоложеное сырье, оно требует контроля в содержании N-вв и особенного отношения (например, увеличения продолжительности белковой паузы).
4. Если в среде нет разветвленных аминокислот, это отрицательно повлияет на органолептику конечного продукта.
Выделение азотистых веществ из клетки дрожжей
Приблизительно 40% абсорбированного азота выделяется дрожжами при дображивании. При неблагоприятных условиях этот процесс может дать дрожжевой привкус и помутнение продукта.