Лигнаны. Лигнаны-соединения, состоящие из двух фенилпропановых единиц, соединенных различными способами. Некоторые из этих соединений аналогичны димерным структурам, присутствующим в макромолекуле лигнина. Многие лигнаны, найденные в экстрактах древесины видов Picea, Pinus, Larix и Tusida содержат цикл тетрагидрофурана, например пинорезинол, лариццирезинол, конидендрин и лиовил. Существуют так же и нециклические структуры с b-b связями между структурными единицами (секоизоларицирезинол) и шестичленные циклы (изоларицирезинол, конидендрин, пликатин). Из древесины Thuja plicata выделен пликатинафтол-лигнан, содержащий нафталиновое ядро(рис.3.)/15/.
Рис.3.
4.1.2.Карбонизация древесины. Процессы образования конденсированных ароматических систем
После гибели дерева древесина либо разлагается микроорганизмами либо, в некоторых природных условиях превращается в ископаемую древесину.
Различают два типа процесса образования ископаемой древесины: силикатизацию (окаменение) и карбонизацию (углификацию). В свете нашей работы интерес представляют химические процессы, происходящие при карбонизации древесины. Рассмотрим их более подробно.
Химический анализ образцов старой и ископаемой древесины указывает на уменьшение содержание полисахаридов и возрастание количества негидролизуемого остатка по мере увеличения возраста и степени деградации. У относительно молодых, но сильно деградированных образцов обнаружили присутствие микроорганизмов.
Из результатов исследований древних образцов дуба, а также образцов березы, ясеня и сосны видно, что на степень деградации влияют окружающие условия, особенно на ранних стадиях. Некоторые старые образцы (возрастом 8500 лет) содержали больше полиоз, чем молодые (возрастом 900 лет).
По увеличению относительного содержания целлюлозы в образцах деградированной древесины видно, что превращения начинаются с полиоз. Быстрее разрушаются легкорастворимые полиозы, в частности пентозаны, чем труднорастворимые. Массовая доля полиоз, растворимых в 5%-ным КОН в ядровой древесине современного образца дуба ,составила 22,4%, а в образце возрастом 8500 лет снизилась до 12,4%,тогда как массовая доля полиоз ,растворимых в 24%-ном КОН, снизилась с 6,1% только до 5,4% /15/.
Деградация полисахаридов начинается на ранних стадиях процесса, однако некоторая часть полисахаридов может сохраняться многие миллионы лет. В образце древесины хвойной породы возрастом 100 млн. лет нашли около 2% сахаров. Из образца древесины из нижнего мелового периода (140 млн. лет назад) выделили 1,1% холоцеллюлозы, в гидролизате которой основными сахарами были глюкоза и манноза. В образце ископаемой древесины семейства Protopinaceae, очевидно, еще сохранились небольшие количества целлюлозы и полиоз даже после 180 млн. лет, так как гидролизаты содержали глюкозу, маннозу и ксилозу.
Лигнин способен сохраняться в течении миллионов лет, но в то же время он может претерпевать изменения даже и за относительно короткие промежутки времени. В молекулах лигнина образцов древесины возрастом 900-4400 лет обнаружили окислительные превращения. Окисление лигнина было замечено также в образцах древесины возрастом 30 млн. лет. Лигнин может терять 2/3 метоксильных групп. ИК-спектры образцов древесины указывают на присутствие конденсированных колец, образовавшихся главным образом из лигнина. С увеличением возраста превращение лигнина в конденсированные ароматические системы усиливается. Битуминозный уголь имеет высокое содержание таких систем. Конденсация ароматических колец служит причиной увеличения содержания углерода в процессе карбонизации. В конце этого процесса получается графит. Ароматические кольца могут возникать и из продуктов деградации полисахаридов. Известно, что пировиноградный альдегид может легко ароматизироваться через хиноны /33/.
В настоящее время каменный уголь является основным источником ПАУ для промышленности. Таким образом, ПАУ, выбрасываемые промышленностью в биосферу, являются производными древесины древних сосудистых растений.
4.1.3.Полиароматические соединения каменноугольной смолы
Каменноугольная смола (креозот) образуется при коксовании каменного угля и является основным источником ПАУ для химической промышленности. Именно креозот является основным источником ПАУ-экотоксикантов.
В составе каменноугольной смолы нами были обнаружены 16 ПАУ, а именно: нафталин, аценафтен, аценафтилен, флуорен, фенантрен, антрацен, флуорантен, пирен, бензантрацен, хризен, бенз[b]флуорантен, бенз[k]флуорантен, бенз[а]пирен, дибензантрацен, бензперилен, инденопирен (Рис.4.). Больше всего в креозоте содержится фенантрена и флуорантена. Суммарно эти вещества составляют 64% фракции ПАУ. Другие вещества, такие как бенз[а]пирен, хотя и составляют 0,7% фракции ПАУ являются сильнейшими канцерогенами.
Химически эти вещества представляют собой многоядерные ПАУ. Содержание нафталина в смеси очень низко. Основная масса ПАУ- трех-, четырех- и более ядерных соединения.
Рис.4.ПАУ каменноугольной смолы
4.2.Лигнин и ПАУ-разрушающие микроорганизмы
Как было отмечено выше, естественным резервуаром микроорганизмов-деструкторов ПАУ являются почва и лесная подстилка. Фитопатогенные грибы, поражающие древесину, также перспективны в плане отбора ПАУ-разрушающих штаммов.
Грибы, разрушающие древесину, подразделяются на четыре группы:
1.Грибы бурой гнили- принадлежат к подотделу базидиомицетов, разрушают, главным образом, полисахариды древесины.
2.Грибы белой гнили- - принадлежат к подотделу базидиомицетов, разрушают, главным образом, лигнин, однако способны разрушать полисахариды.
3.Грибы мягкой гнили- сумчатые и несовершенные грибы, разрушают полисахариды и лигнин.
4.Грибы синевы- сумчатые и несовершенные грибы, живут, главным образом, за счет остаточных белков паренхимных клетках. Ограничено разрушают полисахариды.
5.Бактерии- способны разрушать полисахариды и лигнин, однако, их морфологические свойства (колониальный рост) не позволяет им выступать в качестве высоко эффективных деструкторов при твердофазной ферментации.
Таким образом, наиболее перспективными для отбора ПАУ-разрушающих штаммов являются грибы белой и мягкой гнили (базидио- и аскомицеты). Рассмотрим влияние их ферментных систем на природные ароматические вещества.
4.2.1.Воздействие грибов белой гнили
Грибы белой гнили вырабатывают различные ферменты, способствующие усвоению лигнина /34/. Некоторые из грибов дают, преимущественно, лакказу, другие пероксидазу и тирозиназу. Процесс выработки ферментов различен в зависимости от того используется фермент внутри или вне гиф.
У всех видов диких грибов обнаружена комбинированная деструкция всех компонентов древесины. Обнаружен фермент, который нуждается в целлобиозе (продукте разложения целлюлозы) для деструкции лигнина при совместном действии с локказой /15/.Этот фермент был назван целлобиозохиноноксиредуктазой. В дальнейшем было показано, что для разложения лигнина грибом Phanerohaete chrisosporium.(синоним Sporotrichum pulverolentum) наличие целлобиозохиноноксиредуктазы не является необходимым. Наличие же лакказы абсолютно необходимо. Мутант гриба, не вырабатывающий этой фенолоксидазы, не способен разрушать лигнин.
Изменение в лигнине под воздействием грибов белой гнили заключается в увеличение содержания карбонильных и карбоксильных групп. Отношение О/С увеличивается, а Н/С понижается. Увеличение содержания кислорода происходит в результате окисления a-углеродных атомов и окислительной деструкции связей между b- и g-углеродными атомами пропановой цепи. В опытах с меченным (14С) лигнином показано, что при действии грибов белой гнили (Coriolus versicolor, Phanerohaete chrysosporium) конечный продукт метаболизма СО2 образуется главным образом из метоксильных групп и в небольшой степени из углерода пропановых цепей и ароматических колец. Далее осуществляется окислительное расщепление b-О-4,b-5, b-1 и b-b связей. При этом получаются мономерные звенья лигнина, которые далее разрушаются посредством раскрытия ароматического кольца. Однако, ароматические кольца могут расщепляться и в полимере лигнина /15/.
4.2.2.Воздействие грибов мягкой гнили
Грибы мягкой гнили вырабатывают ферменты, разрушающие все компоненты древесины. Деструкция лигнина грибом Chaetomium globosum до общей потери массы древесины 12% заключается в деметилировании. С увеличением потери массы происходит дальнейшее разложение лигнина. Исследования показали, что при этом не происходит накопление ароматических соединений, следовательно грибы мягкой гнили разрушают ароматические кольца и в самом лигнине и в продуктах.
4.2.3.Действие бактерий
Способность различных бактерий разрушать мономеры и предшественники лигнина показано в опытах с модельными соединениями /35,36/. Однако, в силу морфологических особенностей бактерии не способны эффективно разлагать его полимерные формы.
Исследования по разрушению ПАУ почвенными бактериями показали, что псевдомонады являются наиболее эффективными деструкторами этих соединений. Исследования показали, что ПАУ эффективно разлагаются псевдомонадами в условиях глубинной и твердофазной ферментации, в ризосфере растений /37/.
Исследования механизмов деструкции ПАУ (фенантрена) культурой Pseudomonas fluorescens показали /4/, что окисление ПАУ бактериями происходит последовательно, то есть ферментная атака направлена только на одно кольцо(Рис.5.).
Рис.5.Механизм деструкции фенантрена
Способность разрушать природные ароматические вещества натолкнула исследователей на мысль об использовании микроорганизмов для разрушения ароматических и полиароматических веществ- отходов химической индустрии. В 1990 году американские исследователи показали, что разрушающие лигнин грибы белой гнили Phanerohaete chrysosporium способны также разлагать полициклические ароматические углеводороды до СО2 /38/. Была так же показана способность бактериальных штаммов разлагать ПАУ /39/. В настоящее время работы по микробной деструкции ПАУ ведутся, практически, во всех развитых странах. Показано /40/, что деструкция ПАУ идет последовательно и начинается с гидроксилирования только одного ароматического кольца (рис.6.).