К1К2 механізму ферментативних реакцій : E + S - ES - E + P
К-1 Вони ввели поняття Vmax і отримали, що крива насиченості (тобто залежність швидкості реакції від концентрації субстрата) є рівнобічною гіперболою. Вони довели, що максимальна швидкість є однією з асимптот кривої, а відрізок, що відсікається на осі абсцис в області максимальної швидкості - другою асимптотою, тобто константа в рівнянні швидкості дорівнює за абсолютним значенням концентрації субстрата, що необхідна для досягнення половини Vmax.
Для більшості ферментів концентрація субстрата, за якої швидкість реакції складає половину максимальної, Км відображає міцність зв’язування субстрата з ферментом. Великі значення Км відповідають слабкому зв’язуванню, і навпаки.
Цікавою особливістю клітинного метаболізму є той факт, що кожна клітина регулює синтез продуктів, що є необхідними для її нормального існування, виробляючи їх в потрібній кількості. В той же час клітина уникає перевиробництва, яке призвело б до марних витрат енергії та матеріалів. Доступність вихідних молекул субстрата або коферментів - основний лімітуючий фактор, і з цієї причини більшість ферментів працює із швидкістю, далекою від максимальної.
Температура також впливає на швидкість ферментативних реакцій. Підвищення температури збільшує їх швидкість, але до певної межі.
Як видно з малюнка, швидкість більшості ферментативних реакцій подвоюється при підвищенні температури на кожні 10 градусів, але після 40 градусів спадає дуже швидко. Збільшення швидкості реакцій відбувається за рахунок підвищення енергії реагуючих компонентів ; зменшення швидкості пов’язано з тим, що в самій молекулі фермента починається вібрація, яка руйнує водневі зв’язки і порушує інші, відносно слабкі взаємодії, що утримують молекулу у певному стані.
На активність фермента впливає і рівень PH навколишнього середовища. Конформація фермента залежить від притягання і відштовхування між негативно (кислотними) і позитивно (основними) зарядженими групами амінокислот. При зміні PH ці заряди змінюються, що призводить до зміни структурної організації фермента - інколи настільки - що він не може функціонувати. Мабуть, найвагомішу роль відіграє зміна зарядів активного центру та субстрата, що відбивається на здатності утворювати зв’язки. Інколи деякі ферменти можуть працювати за рівня PH, далекого від максимального. Припускають, що це протиріччя є не ‘помилкою’ процеса еволюції, а способом регуляції активності ферментів.
КОФЕРМЕНТИ і КОФАКТОРИ
Живі системи мають механізми включення та інгібування активності фермента. Деякі ферменти утворюються в неактивній формі, а потім за необхідності вони активуються - переважно іншими речовинами, їх та інші небілкові фактори регуляції ферментативної активності наз. кофакторами.
Одним з прикладів кофакторів є іони, які виступають у цій ролі для деяких специфічних ферментів. Наприклад, іон магнію необхідний для більшості ферментативних реакцій, під час яких здійснюється переніс
2+ фосфатних груп між молекулами. Два позитивних заряди Mg утримують в певному положенні негативно заряджені фосфатні
++ групи. Інші іони (наприклад, K ,Na , тощо) виступають в аналогічній ролі в інших ферментативних реакціях. В деяких випадках іони можуть сприяти об’єднанню ферментативних білків.
Інколи дуже важливу роль у ферментативних реакціях відіграють коферменти. Ще на межі XIX - XX ст. було встановлено, що для нормального живлення, крім солей, білків, жирів та вуглеводів, потрібні ще особливі речовини, які Ф.Гопкінс назвав додатковими харчовими факторами, а Функ у 1911 р. - вітамінами. Це відкриття було стимулом для вивчення ролі цих речовин в процесі метаболізму, для дослідження питання про те, чому вони є необхідними для одних організмів і зовсім не потрібні іншим. Лише зараз твердо встановлено, що ці речовини необхідні всім живим організмам (значення вітамінів для організмів вперше встановив російський лікар М.Лунін у 1880 р.). Багато організмів, однак, здатні синтезувати всі вітаміни, які їм необхідні, а ті організми, що не мають пристосування до синтезу вітамінів, повинні отримувати їх із їжею.
Специфічна роль вітамінів в процесі обміну тепер є загальновідомою. В усіх вивчених випадках виявилось, що вони стають частиною більш крупної молекули, яка функціонує в якості кофермента і є абсолютно необхідною для протікання певних реакцій. Захворювання, що викликані нестачею вітамінів, - це наслідки порушень метаболізму, зв’язаних з нестачею того чи іншого ферменту. Отже, тепер ми впритул підійшли до коферментів і розглянемо деякі з механізмів їх роботи.
Наприклад, в деяких окислювально-відновних процесах електрони
_ передаються молекулі, яка виступає акцептором e . У будь-якій клітині можна виявити декілька різних акцепторів електронів, кожен з яких специфічно пристосований для утримання електрона на певному енергетичному рівні. Прикладом може слугувати NAD -нікотинамідаденіндинуклеотид.
На перший погляд NAD здається складним і, однак він складається з добре нам відомих компонентів біологічних молекул. Два п’ятивуглецевих цукрів (рибози) з’єднані двома фосфатними групами. Один цукор зв’язаний з аденіном, а другий - з іншою азотистою основою- нікотинамідом. Нікотинамідне кільце - активний кінець NAD - приєднує _ e-ни. Нікотинамід - це вітамін, що називається ніацином. Як вже зазначалось вище, вітаміни є сполуками, які необхідні в невеликих кількостях живим організмам ; люди і тварини не можуть синтезувати вітаміни і тому мусять отримувати їх із їжею. Клітини людини можуть синтезувати NAD, якщо в їжі міститься нікотинамід. Багато вітамінів є коферментами або частиною коферментів.
Нікотинамідаденіндинуклеотид, подібно до багатьох коферментів, піддається циклічним перетворенням. Так NAD+
+ _ регенерує, коли NADH+H передає свої e - ни іншому акцептору. Таким чином, наявне число молекул NAD відносно невелике, хоча він бере участь в багатьох внутрішньоклітинних ферментативних реакціях.
Деякі ферменти використовують кофактори, котрі знаходяться в комплексі з білком. До них відносяться так звані простетичні групи, наприклад, залізо-сірковмісна група фередоксинів (білок, який бере участь у процесі фотосинтезу у рослин шляхом відновлення NADP до NADPH2), піридоксальфосфат (вітамін B2) або трансаміназ.
Також коферменти беруть участь у переносі специфічних хімічних груп. Оскільки кінцевий фосфатний зв’язок АТФ (регулювання, зв’язане з гідролізом АТФ, детально розглядається далі) легко розривається з виділенням вільної енегрії, це з’єднання є ефективним джерелом фосфата для великої кількості різних реакцій фосфорелювання. Багато різноманітних, хімічно лабільних зв’язків поводиться подібним чином. Наприклад, специфічні молекули - переносчики містять ацетильні або метильні групи, з’єднані реактивними зв’язками, що дозволяє цим групам легко переходити на інші молекули. Одна й та сама молекула - переносчик нерідко бере участь у багатьох різних реакціях біосинтезу, для проходження яких необхідна наявність їх специфічних реакційноздатних груп.
Прикладом такого кофермента - переносчика може слугувати ацетилкофермент А (ацетил - СоА), що утворюється під час розщеплення глюкози. Він переносить ацетильну групу, приєднану до нього лабільним тіоефірним зв’язком.
Ця ацетильна група легко переходить на іншу молекулу, таку, наприклад, як молекула жирної кислоти. Інший приклад, що заслуговує на увагу - це біотин, який переносить в багатьох реакціях біосинтезу
_ карбоксильну групу (-- СОО ).
В наведеній послідовності реакцій біотин ковалентно зв’язаний з ферментом піруват-карбоксилазою. Активована карбоксильна група, що
_ утворюється з бікарбонат-іона (HCO3 ), зв’язується з біотином в реакції, що протікає за рахунок енергії, виділеної під час гідролізу АТФ. Потім карбоксильна група переноситься до метильної групи групи пірувату з утворенням оксалоацетата.
Нижче наведені деякі коферменти, що беруть участь в реакціях переносу хімічних груп.
| Кофермент | Група, що переноситься |
| АТФ | фосфатна |
| NADH, NADPH | _ водень + е (гідрид-іон) |
| CoA | ацетильна |
| Біотин | карбоксильна |
| S - Аденозилметионін | метильна |
Деякі коферменти можуть бути настільки міцно зв’язаними з білковою молекулою фермента, що фактично є її частиною. Як приклад можна навести гени, що містять в собі залізо, в молекулі гемоглобіна або цитохромів ; тіамінпірофосфат у ферментів, що беруть участь в переносі карбоксильної групи. В процесі еволюції кожен кофермент був відібраний за певною ознакою хімічної активності, яку він проявляє в комплексі з білком. Досить часто коферментами є дуже складні органічні молекули, хімічні якості яких в комплексі з білком не завжди зрозумілі в деталях. Крім реакційно здатного центру до складу коферментів нерідко входять залишки, що зв’язують їх з відповідними білками.
РОЛЬ АТФ У РОБОТІ ФЕРМЕНТІВ
Жива клітина є далека від рівноваги хімічна система ; адже наближення живої системи до рівноваги означає її розпад і смерть. Продукт кожного фермента звичайно швидко витрачається, оскільки використовується в якості субстрата іншим ферментом даного метаболічного шляху. Ще більш важливо, що велика кількість ферментативних реакцій зв’язана з розщепленням АТФ на АДФ та неорганічний фосфат. Щоб це було можливим, пул АТФ в свою чергу повинен підтримуватись на рівні, далекому від рівноваги, так щоб відношення концентрації АТФ до концентрації продуктів його гідролізу було високим. Таким чином, пул АТФ відіграє роль ‘акумулятора’, що підтримує постійний переніс в клітині енергії та атомів по метаболічним шляхам, що визначаються присутніми ферментами.