В последние годы разработан ряд новых полимерных сорбентов для эксклюзионной хроматографии в водных системах. На рис. 5 приведены калибровочные кривые для некоторых материалов. Гели шодекс ОН-пак изготавливают на основе поливинилового спирта (серия Q) и полиглицидилметакрилата (серия В). Первые предназначены для разделения в низкомолекулярной области (М<1500 по полиэтиленгликолю или 5000 по декстрану), а вторые – для высокомолекулярного диапзона. Оптимальная рабочая температура для колонок с этими материалами составляет 50 °С. Сорбенты типа ионпак 5 представляет собой сульфированные стирол-дивинилбензольные гели и особенно пригодны для разделения полиолов и исследования молекулярно-массового распределения полисахаридов (рис. 4.8) при рабочих температурах 40–80 °С. TSK-гели типа PW дают очень хорошие результаты при определении ММР водорастворимых синтетических полимеров (полиакриламиды, соли полиакриловой кислоты, поливинилпирролидон и т.д.), а также алеиновых кислот, полиэтиленоксида и полисахаридов. Эти материалы обладают наилучшими характеристиками для высокоэффективной эксклюзионной хроматографии поликатионов в водНОЙ среде. В качестве подвижных фаз при анализе неионных веществ на этих сорбентах используют воду или 0,005 – 0,1 М водные растворы солей (например, NaCI или КСl); для разделения полиэлектролитов на TSK-геле типа PW применяют буферные системы. Наиболее мелкопористые гидрофильные гели очень эффективны для разделения низиомолекулярных соединений.
К недостаткам полужестких гелей следует отнести ограничение по растворителям, значительное время уравновешивания колонок и возможное снижение их эффективности при замене подвижной фазы, а также относительно невысокое предельное рабочее давление. Кроме того, эффективность колонок с полужесткими гелями может резко понизиться при попадании в них пузырьков воздуха. Воздух блокирует поры геля и очень трудно удаляется. Поэтому при работе с полужесткими гелями требуется особенно тщательная дегазация растворителя и внимательная сборка хроматографической системы.
Жесткие гели
Из жестких неорганических сорбентов в эксклюзионной хроматографии используют, главным образом, силикагели и в значительно меньшей степени пористые стекла. Основными достоинствами этих материалов является возможность использования с любым растворителем, простота их замены, высокая устойчивость к давлению и температуре и относительная легкость упаковки, колонок. Главный недостаток жестких гелей – адсорбционная активность, которая в наибольшей степени выражена у пористых стекол. Для ее устранения поверхность модифицируют силанизацией или прививкой различных групп, в частности сложноэфирных (µ-бондагель Е), остатков глицерина (гликофаза G/CPG) и др. К сожалению, модификацией поверхности полностью подавить адсорбцию обычно не удается. Поэтому приходится устранять ее путем различных добавок к подвижной фазе, которые взаимодействуют с сорбентом сильнее, чем анализируемые вещества. При работе в органических средах в качйстве модифлкаторов часто применяют тетрагидро-фуран и додигликоли (если, конечно, нельзя по каким-либо причинам, вести разделение в чистом полярном растворителе). При работе в водных растворах и анализе полиэлектролитов к элюенту добавляют, различные соли (иногда кислоты и основания), подавляющие: адсорбционные и полиэлектролитные эффекты. Друдой недостаток жестких гелей–ограниченное разрешение в области низких молекулярных масс: для данного диапазона лучше использовать полужесткие сорбенты.
Первоначально для разделения полимеров применяли различные промышленные силикагели. Изучен ряд силикателей, выпускаемых в СССР, и предложен набор из четырех марок (КСК-2; КСК-1; силохром СХ-1 и МСА-2500), перекрывающий диапазон молекулярных масс от 103 до 106. Главный недостаток промышленных силикагелей заключается в плохой воспроизводимости их характеристик за счет весьма широких допусков, которые вполне допустимы при их использовании в технике. Кроме того, существенным затруднением является необходимость размола и выделения узких фракций с требуемым размерим частиц, как описано в разд. 5.1. Поэтому были разработаны силикагели, специально предназначенные для эксклюзионной хроматографии. Первым из таких сорбентов был лихросфер. Сферические частицы сорбента имеют большой удельный объем пор, хорошие механические свойства и позволяют получить колонки достаточно высокой эффективности.
Значительно лучшие результаты достигаются при использовании зорбакса PSM, получаемого по особой технологии. Этот сорбент выпускают с тремя размерами пор, перекрывающих диапазон молекулярных масс от 102 до 2–106. Для снижения адсорбции при работе в органических растворителях его поверхность силанизируют, а в водных системах используют не обработанный сорбент. Зорбакс PSM характеризуется исключительной однородностью пор, что в сочетании с малым диаметрОМ частиц и их умеренно узким распределением по размеру обеспечивает высокую эффективность колонок.
Комбинация колонок с зорбаксами PSM-60 и PSM-1000 дает линейную калибровочную зависимость в диапазоне от 2–102 до 2–106. Фирмой «Дюпон» выпущены «тримодальные» колонки, содержащие смесь зорбаксов PSM-60, PSM-300 и PSM-3000, с линейной калибровочной зависимостью в пределах 102-107 Для обеспечения необходимой селективности разделения' рекомендуется использовать наборы из двух и более колонок. Зорбакс PSM, видимо, является лучшим из жестких сорбентов, не дназначенных для исследования биополимеров. Калибровочные кривые для жестких сорбентов по полистиролу в тетрагидрофуране приведены на рис. 8.
Пористые стекла в немодифицированном виде в последнее время применяют редко, так как они обладают значительно большей адсорбционной активностью, чем силикагель. Отличительной особенностью пористых стекол является чрезвычайно узкoe распределение пор по размеру, поэтому они характеризуются очень высокой селективностью разделения, но в малом диапазоне молекулярных масс.
К сорбентам для высокоэффективной эксклюзионной хроматографии белков, ферментов и других биологических объектов предъявляются значительно более жесткие требования по инертности поверхности, чем к сорбентам для разделения синтетических полимеров. Кислые силанольные пруппы силикагеля обладают высокой адсорбционной активностью, проявляют слабые ионообменные свойства и способны денатурировать белковые молекулы. Поэтому поверхность жестких сорбентов очень тщательно модифицируют прививкой монослоев нейтральных гидрофильных органических гpyпn. К таким сорбентам относятся ц-бондагель Е и материалы, содержащие глицерильные группы. Поверхность ц-бондагеля Е модифицирована алифатически-ми эфирными группами. Колонки с этим сорбентом можно использовать с любыми растворителями от пентана до буферных растворов в области рН от 2 до 8. Они характеризуются высокой разрешающей способностью, но из-за малого рабочего объема (примерно 1,2 мл на колонку) требуется особо точная подача подвижной фазы.
Качество получаемых сорбентов во многом определяется полнотой реакции. Теоретически в указанную реакцию может вступить примерно половина всех силаноль-ных групп. Однако оставшиеся группы не могут взаимодействовать с сорбентами, так как экранируются глицерильными группами. При недостаточной степени покрытия полного экранирования не пооисходит и начинает проявляться «силанольная активность» незамещенных групп. Содержание таких активных групп, характеризующее уровень дезактивации сорбентов, часто оценивают по степени сохранения ферментативной активности лабильных ферментов после их пропускания через хроматографическую колонку.
Наиболее известными представителями материалов указанного типа является гликофаза CPG, получаемая из пористых стекол марки CPG(ControlledPorousGlass), лихросфер диол и синхропак GPC. Эти гели характеризуются весьма высокой инертностью: так, потеря ферментов при хроматографировании на лихросфере диол обычно не превышает 2–7%. Сорбенты синхропак GPC, по данным фирмы, обеспечивают полное сохранение ферментативной активности.
Наилучшими свойствами для эксклюзионной хроматографии биополимеров обладают TSK-гели типа SW. Поверхность этих материалов покрыта гидрофильными ОН-грутопами по особой технологии, обеспечивающей исключительную инертность сорбента, практически не уступающую сефадексу. Поэтому эксклюзионное разделение, как правило, не осложняется побочными сорбционными процессами. TSK-гели SW выпускают с тремя размерами пор; и они перекрывают диапазон молекулярных масс от 5*102 до 4*105 (по декстрану) или до 106 (по глобулярным белкам). За счет большого объема пор колонки, с этими гелями характеризуются высокой разделительной способностью, а их гарантированная эффективность составляет 16 тыс. т.т./м.
Хотя подавляющее большинство разделений на жестких гелях с привитыми гидрофильными группами проводят в водных системах, эти материалы могут быть использованы и в сочетании с полярными органическими элюентами (тетрагидрофуран, диметилформамид, этанол), что расширяет возможности их применения.
Успехи, достигнутые за последние несколько лет при разработке сорбентов для высокоэффективной эксклюзионной хроматографии, позволяют предполагать, что в скором времени будут созданы новые материалы с еще более высокими характеристиками.
Сорбенты для ионообменной хроматографии
В ионообменной хроматографии применяют разнообразные сорбенты, используемые как для разделения белков, так и для разделения неорганических ионов и небольших молекул. Эти сорбенты можно разделить на при основных вида: ионообменные смолы, пелликулярные материалы и силикагель с химически привитой фазой, обладающей ионообменными свойствами. Пелликулярные сорбенты в настоящее время практически не применяют, их используют лишь для заполнения предколонок и при воспроизведении старых методов.