3. Кинетика ферментативных реакций. Механизмы ферментативных реакций
Использование энергии связывания фермента с субстратом в катализе; природа сил, стабилизирующая различные конформационные состояния системы фермент-субстрат (водородные связи, гидрофобные взаимодействия и др.); типы катализа, используемые в ферментативных реакциях; функциональные группы ферментов. Понятие ферментативной активности. Способы выражения ферментативной активности. Влияние концентрации фермента на скорость ферментативной реакции. Влияние концентрации субстрата. Теория Михаэлиса-Ментен. Способы графического определения константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции. Влияние температуры и рН среды на скорость ферментативных реакций. Ингибиторы ферментов и их классификация. Конкурентное, неконкурентное, бесконкурентное, смешанное ингибирование. Способы определения типа и константы ингибирования. структура и механизм действия ферментов отдельных групп
4. Механизмы регуляции ферментативной активности
Разные типы регуляции активности ферментов; полифункциональные ферменты, функциональные преимущества, возникающие в результате белок-белковых взаимодействий в составе молекулы полифункциональных ферментов; четвертичная структура ферментов, роль четвертичной структуры в стабилизации молекулы фермента и регуляции активности ферментов. Уровни регуляции ферментативной активности. Регуляция путём изменения количества ферментов и путём изменения их индивидуальной каталитической активности. Нековалентная и ковалентная модификация. Способы контроля разветвлённых метаболических путей.
5. Методы выделения и очистки ферментов
Экстрагирование ферментов из биологического материала. Кислотная обработка, термическая обработка, фракционирование солями, органическими растворителями, метод избирательной адсорбции, ионообменная хроматография, гельфильтрация, аффинная хроматография, электрофорез, изоэлектрофокусирование, ультрацентрифугирование, кристаллизация. Комбинирование различных методов для очистки ферментов на примере глюкозо‑6‑фосфатдегидрогеназы печени крыс. Критерии чистоты ферментных препаратов.
6. Локализация ферментов
Тканевое, региональное, клеточное и субклеточное распределение ферментов. Ферменты – маркеры субклеточных структур: ядерные, митохондриальные, лизосомальные, цитозольные ферменты. Использование ферментов-маркеров в диагностике и научных исследованиях.
Требования к уровню освоения программы
В результате изучения данной дисциплины студент должен знать классификацию и номенклатуру ферментов, их строение и механизмы функционирования, а также современные методы работы с ферментами; уметь применять приемы номенклатуры ферментов, давать характеристику важнейшим из них; владеть приемами и навыками работы с ферментами.
Перечень вопросов к экзамену:
История изучения классификации ферментов.
Современная международная номенклатура EC – enzyme code.
Организации, занимающиеся вопросами классификации и номенклатуры – IUBMB IUPAC.
Значение и недостатки единой системы номенклатуры.
Классы ферментов, подклассы и подподклассы.
Белковые и небелковые ферменты (рибозимы).
Простые и сложные ферменты.
Холофермент, апофермент, коферменты: кофакторы и простетические группы.
Общие механизмы действия кофакторов.
Классификация коферментов.
Характеристика основных представителей различных групп.
Строение активного центра ферментов, субстратсвязывающий и каталитический центр.
Методы идентификации активного центра ферментов.
Механизмы ферментативной реакции.
Понятие ферментативной активности.
Способы выражения ферментативной активности.
Влияние концентрации фермента на скорость ферментативной реакции. Влияние концентрации субстрата.
Теория Михаэлиса-Ментен.
Способы графического определения константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции.
Влияние температуры и рН среды на скорость ферментативных реакций. Ингибиторы ферментов и их классификация.
Уровни регуляции ферментативной активности.
Регуляция путём изменения количества ферментов и путём изменения их индивидуальной каталитической активности.
Способы контроля разветвлённых метаболических путей. Экстрагирование ферментов из биологического материала.
Кислотная обработка, термическая обработка, фракционирование солями, органическими растворителями, метод избирательной адсорбции, ионообменная хроматография, гельфильтрация, аффинная хроматография, электрофорез, изоэлектрофокусирование, ультрацентрифугирование, кристаллизация.
Критерии чистоты ферментных препаратов.
Тканевое, региональное, клеточное и субклеточное распределение ферментов.
Ферменты – маркеры субклеточных структур.
Использование ферментов-маркеров в диагностике и научных исследованиях.
Список основной литературы
1. Кретович В.Л. Введение в энзимологию. – М.: Наука, 1986. – 332 с.
2. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. – М.: Мир, 1982. – Т. 1 – 3.
3. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. – М.: Мир, 1980. – 432 с.
4. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. – М.: Мир, 1986. – 374 с.
5. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. – М.: Высш. школа, 1980. – 272 с.
6. Практикум по биохимии/ под ред. С.Е. Северина и Г.А. Соловьёвой. – М.: МГУ, 1989. – 509 с.
7. Ленинджер А. Основы биохимии. – М.: Мир, 1985. – 260 с.
8. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты. – М.: Наука, 1978. – С. 11–41.