В приведенных выше научных работах было указано на серьезные изменения во внутренних органах животных, независимо от того, какой сорт или линия ГМ-культуры использовались. Одной из причин опасности ГМО может быть несовершенство «встраивания» гена в геном другого организма (Кузнецов с соавт., 2004; Wilson et al., 2004). В настоящее время наиболее распространенными являются два способа введения гена: агробактериальный и биобаллистический. При применении первого способа используют плазмиды (кольцевые ДНК) почвенных бактерий, с помощью которых и «встраивают» нужный ген в геном клетки. При биобаллистическом способе в специальной вакуумной камере производят «обстрел» растительных клеток микроскопическими вольфрамовыми или золотыми частицами с нанесенными на них генами и нуклеотидными последовательностями, управляющими этими генами (прямой ввод гена в геном клетки-хозяина). При обоих способах «встраивания» гена производят селекцию трансформированных клеток и регенерацию трансгенных растений. Наиболее распространенным является агробактериальный способ введения целевого гена. Оба способа «встраивания» гена являются несовершенными и не дают полной гарантии безопасности тех организмов, которые создаются с их помощью. При биобаллистическом способе достаточно высокая вероятность «встраивания» сразу многих копий ДНК-векторов, «обрывков» ДНК и других сбоев. При этом могут появляться растения с неизвестными свойствами. Второй способ - агробактериальный - является еще более опасным и непредсказуемым, чем первый. Cторонники ГМО утверждают, что ГМ-вставки полностью разрушаются в желудочно-кишечном тракте человека. Однако, по мнению российских генетиков «… поедание организмов друг другом может лежать в основе горизонтального переноса, поскольку показано, что ДНК переваривается не до конца и отдельные молекулы могут попадать из кишечника в клетку и в ядро, а затем интегрироваться в хромосому» (Гвоздев, 2004, стр.70). Что же касается колечек плазмид, то «кольцевая форма ДНК делает ее более устойчивой к разрушению» (Янковский и Боринская, 2004, стр.36). Так, плазмиды и ГМ-вставки были обнаружены как в содержимом кишечника (Chowdhury et al., 2003), так и в клетках разных органов животных и человека, использующих в пищу ГМО: в крови и микрофлоре кишечника мышей (Schubbert и др., 994), в крови, селезенке, печени, мозге, сердце и коже внутриутробных плодов и новорожденных мышат при добавлении в корм беременных самок мышей бактериофаг М-13 или плазмид с геном зеленого флуоресцентного белка (pEGFP-C1) (Schubbert et al., 1998); в слюне и микрофлоре кишечника человека (Mercer,1999; Coghlan, 2002).
В научной литературе практически отсутствуют данные о воздействии ГМ-растений на потомство млекопитающих. Проведение таких экспериментов очень важно, поскольку мы имеем дело с искусственной модификацией растений. В результате генетических манипуляций создаются растения, неизвестные природе. Важной задачей является изучение взаимодействия ГМ-растений с другими живыми организмами, их влияние на эти организмы и их потомство. Целью настоящей работы было исследование воздействие ГМ-сои (RR, линия 40.3.2), устойчивой к гербициду раундапу, на физиологическое состояние и выживаемость крысят первого поколения.
Методика.
В экспериментах участвовали 4 группы крыс Wistar, весом 200-220гг. Самок крыс первой группы («Контроль») кормили стандартным виварным кормом без каких-либо добавок. Самки трех других групп получали к корму добавку в виде соевой муки, разведенной водой. Самкам второй группы к стандартному виварному корму добавляли соевую муку ГМ сои, устойчивую к гербициду раундапу (трансген EPSPS CP4, Roundup Ready, RR, линия 40.3.2, Monsanto, содержание белков ~35%). Самкам третьей группы к корму добавляли соевую муку Изолята белка ГМ-сои (RR, линия 40.3.2, содержание белков ~ 90%), а четвертой – соевую муку традиционного сорта сои Arcon SJ 91-330 (содержание белков ~35%). Поставщиком соевой муки была американская компания ADM. Муку ГМ сои и Трад. сои получали путем помола соевых семян в соответствующих компаниях. В составе стандартного виварного корма не было сои или соевого шрота. Таким образом, в экспериментах участвовало четыре группы крыс: 1-я группа – «Контроль», 2-я группа - «ГМ-соя»; 3-я группа – «Изолят белка ГМ-сои», 4-я группа – «Трад. соя». Исследования проводили одновременно со всеми группами.
Было проведено три серии экспериментов на разных крысах. Каждую последующую серию экспериментов на новых крысах повторяли через 2-3 месяца. Сою добавляли к виварному корму самкам крыс Wistar за две недели до спаривания, во время спаривания, беременности и выкармливания крысят. Процедура эксперимента была следующей. В каждой клетке находилось по три самки, которым к стандартному виварному корму добавляли соевую пасту (20г соевой муки, разведенной 40 мл воды): на каждую крысу по 5-7г соевой муки. Соевую пасту ставили в отдельной плошке внутрь клетки. Через две недели после начала кормления в клетку самок подсаживали по очереди двух самцов (по три дня каждый). Перед рождением крысят каждую самку отсаживали в отдельную клетку. После рождения крысят количество сои увеличивали до 1г на одного родившегося крысенка, а после того, как крысята подрастали и начинали есть сами, увеличивали до 2-3г. Регистрировали вес крысят, которые родились, примерно, в одно и то же время +1-2 дня (~80%крысят), и подсчитывали количество родивших самок, число рожденных и умерших крысят. Было исследовано 30 самок и 221 крысенок. У части крысят были извлечены органы для определения веса и гистологического анализа. Органы фиксировали в растворе формальдегида 0.1M PBS, pH7.2.
Статистический анализ.
Для статистического анализа уровня смертности использовали One-Way ANOVA с применением Newman-Keuls теста для долевого участия; для анализа веса использовали Mann-Whitney, для распределения веса у крысят - Chi-square в программе StatSoft Statistica v6.0 Multilingua (Россия).
Результаты
После добавления к общевиварному корму самок до спаривания, во время спаривания, беременности и лактации генетически модифицированной сои в группах «ГМ-соя» была выявлена высокая смертность крысят (~ 51,6%), которая была статистически достоверно выше, чем смертность крысят в группах «Изолят белка ГМ сои» (15,1%), «Трад. соя» (10%) и «Контроль» (8,1%) (табл.1,2; рис.1). Высокая смертность крысят из группы «ГМ-соя» наблюдалась у всех самок во всех трех сериях, при этом наблюдалось некоторое снижение уровня смертности от серии к серии, но оно было статистически недостоверным (рис.2) и, возможно, было связано с уменьшением свежести соевой муки. Уровень смертности крысят в группе «Изолят белка ГМ-сои» был ниже, чем в группе «ГМ соя», но выше, чем в группах «Трад. Соя» и «Контроль». В последних двух случаях различие было статистически недостоверным.
ГМ соя не повлияла на рождаемость крысят: в среднем на одну самку было 10-11 крысят как и в группах «Контроль» и «Трад. соя» (табл.1). В то же самое время рождаемость крысят в группе «Изолят белка ГМ-сои» была достоверно меньше, чем в других группах (в среднем на одну самку ~8 крысят).
Смертность крысят в группах «Контроль», «Трад. соя» и «Изолят белка ГМ-сои» наблюдалась в течение двух недель, а в группе «ГМ-соя» - в течение трех недель.
Анализ веса крысят через две недели после рождения показал пониженный вес у крысят из группы «ГМ-соя» по сравнению с весом крысят из групп «Трад. соя» и «Контроль» (табл.3 А, Б), при этом более трети крысят из группы «ГМ-соя» имели очень низкий вес (менее 20г) по сравнению с группами «Контроль» и «Трад-соя», что свидетельствовало об ослабленном состоянии большого количества крысят из группы «ГМ-соя» (табл.3 Б, В; рис.3, 4). Были также обнаружены небольшие изменения по ряду изучаемых параметров и при добавлении традиционной сои (табл.3, А, Б, В). Так, вес основной части крысят из группы «Трад. соя» был меньше, чем вес крысят из «Контроля», и, в основном, приходился на интервал от 20 до 30г (табл.3). Любопытно, что масса внутренних органов ослабленных крысят из группы «ГМ-соя» была значительно меньше, чем масса органов нормальных крысят из других групп, за исключением массы мозга (табл.4). Это свидетельствовало о том, что эти крысята были того же возраста, что и крысята из контрольных групп, но произошло недоразвитие внутренних органов, возможно, из-за гормонального дисбаланса.
Таким образом, были выявлены серьезные статистически достоверные изменения по развитию и выживаемости у крысят из группы «ГМ-соя» по сравнению с крысятами из групп «Трад соя», «Изолят белка ГМ-сои» и «Контроль».
Обсуждение
Проведенные исследования показывают, что добавление к корму ГМ сои, устойчивой к гербициду раундапу, привело к повышенной смертности и пониженному весу крысят первого поколения, что не наблюдалось при добавлении традиционной сои, изолята белка ГМ сои или при отсутствии соевых добавок. Несмотря на то, что в группе «Контроль» крысята получали меньше питательных веществ, они были более жизнеспособными и здоровыми, чем в других группах и, особенно, в группе «ГМ-соя». Можно выдвинуть несколько версий негативного влияния ГМ сои на потомство. С одной стороны, это может быть связано с неустойчивостью и нестабильностью генетической конструкции и проникновением чужеродных генов, в том числе и фрагментов плазмид, в клетки репродуктивных органов и в половые/стволовые клетки животных согласно многочисленным экспериментальным данным (Gruzza et al., 1993; Schubbert с соавт., 1996, 1998; Netherwood et al., 1999). Нестабильность генетической вставки была показана для сортов трансгенной сои (Windels et al., 2001) и трансгенного риса (Yang et al., 2005).