Мембранная энзимология (стр. 1 из 10)

Мембранная энзимология

Введение

Биомембрана - это не просто некая пассивная структура, ограничивающая водные компартменты. Уже краткое знакомство с типами ферментов, связанных с мембранами, показывает, насколько разнообразны ассоциированные с мембранами каталитические активности.

Трансмембранные ферменты, катализирующие сопряженные реакции на противоположных сторонах мембраны. Типичные ферменты этого класса имеют несколько активных центров. Характерными примерами могут служить окислительно-восстановительные ферменты, например фотосинтетические реакционные центры растений и бактерий или цитохром с-оксидаза митохондрий. Расположенные на противоположных сторонах мембраны активные центры этих ферментов сопряжены друг с другом с помощью потока электронов, генерирующего трансмембранный электрический потенциал. К этому классу ферментов могут быть отнесены также многие рецепторы. Связывание лиганда с доменом, локализованным с наружной стороны клеточной мембраны, приводит к изменениям в цитоплазматическом домене фермента, которые в свою очередь инициируют клеточный ответ. В этом случае через мембрану переносится информация, а не заряды или какие-либо растворенные молекулы. Показано, что некоторые рецепторы являются тирозиновыми протеинкиназами и, следовательно, представляют собой мембранные ферменты, обладающие каталитической активностью. Большинство же мембранных рецепторов сами по себе не катализируют никаких химических реакций и не являются в этом смысле ферментами.

Трансмембранные ферменты, участвующие в транспорте веществ. Многие мембранные белки участвуют в транспорте молекул через бислой. Активный транспорт может быть сопряжен с гидролизом ATP, как в случае Са** - АТРазы саркоплазматического ретикулума. Движущей силой активного транспорта могут быть также ионные градиенты. Например, транспорт лактозы через плазматическую мембрану Е. coli с помощью лактозопермеазы сопряжен с поглощением протонов и зависит от трансмембранного градиента электрохимического потенциала.

Белки, являющиеся компонентами электронтранспортных цепей. Наиболее типичные ферменты этого класса - компоненты дыхательной цепи митохондрий, заканчивающейся, цитохром с-оксидазой; ферменты системы электронного транспорта микросом, включающие цитохром Р450 и цитохром bs; элементы фотосинтетической электронтранспортной цепи в тилакоидах. Локализация компонентов электронтранспортных цепей в мембране приводит к увеличению их локальной концентрации, что позволяет значительно ускорить перенос электронов между молекулами. Основной вопрос состоит в том, являются ли компоненты соответствующих электронтранспортных цепей свободно диффундирующими в плоскости мембраны белками или они находятся в мембране в виде более или менее долгоживущих суперкомплексов.

Ферменты, способные использовать мембраносвязанные субстраты. В этот класс могут входить ферменты, участвующие в метаболизме компонентов мембраны: фосфолипидов, гликолипидов, полиизопреноидных соединений и стероидов, а также ферменты, участвующие в процессинге мембранных и секреторных белков. В большинстве случаев эти ферменты являются интегральными мембранными белками, но иногда представляют собой растворимые белки, лишь временно связанные с мембраной. Примерами белков этого типа являются лидерная пептидаза из Е. coli и фосфолипаза С, связанные с мембраной посредством гликозилфосфа-тидилинозитольиого якоря.

Ферменты, использующие водорастворимые субстраты. Многие мембраносвязанные ферменты используют растворимые субстраты. В некоторых случаях фермент локализуется в такой области мембраны, где велика концентрация субстрата. Например, ацетилхолинэстераза, катализирующая гидролиз ацетилхолина, по-видимому, фиксируется в постсинаптической мембране с помощью ковалентной сшивки с фосфатидилинозитольным гликолипидом. Целый ряд ферментов, участвующих в гидролизе крахмала и белков, прикрепляется к мембранам микроворсинок кишечника с помощью гидрофобных доменов, расположенных в N-концевой части полипептидов. Вероятно, связь этих пищеварительных ферментов с мембраной позволяет создать локально высокую концентрацию растворимых молекул, что способствует их эффективному поглощению клеткой. В качестве примера можно привести два фермента из этой группы: сахараза-изомальтаза и мальтаза-глюкоамилаза.

Ферменты, образующие мембраносвязанный комплекс для облегчения канализации субстрата. Мембраны могут служить своеобразным организующим каркасом, с которым связываются периферические ферменты с образованием мультиферментного комплекса. Имеются косвенные данные о том, что участвующие в реакциях цикла Кребса ферменты матрикса митохондрий связываются с мембраной таким образом, что продукт одного фермента становится субстратом другого, не выходя за пределы мультиферментного комплекса. Такой механизм мог бы облегчить метаболические превращения. Поскольку ферменты в суперкомплексах связаны друг с другом слабыми связями, с определенностью продемонстрировать их существование довольно трудно.

Ферменты, которые совершают челночные перемещения между цитозолем и мембраной и активность которых модулируется связыванием с мембраной. Эта группа мембранных ферментов обнаружена недавно. Они способны связываться либо прямо с поверхностью фосфолипидного бислоя, либо со специфическими белковыми рецепторами. Чаще всего эти ферменты активируются при связывании с мембраной, но иногда наблюдается и их инактивация. Типичными примерами ферментов, активирующихся при связывании, являются пируватоксидаза из Е. cod, протеинкиназа С и некоторые ферменты, участвующие в каскаде свертывания крови.

В первую очередь следует отметить ключевую роль липидного окружения мембранных ферментов в проявлении их активности. Этот фактор может очень сильно усложнить интерпретацию кинетических данных и потребовать значительных экспериментальных усилий в реконструкции очищенных интегральных мембранных ферментов с фосфолипидами, с тем чтобы приблизить условия работы фермента к условиям invivo или по крайней мере создать для фермента подходящее окружение.

1. Некоторые специфические положения, имеющие отношение к активности мембранных ферментов

Проблема изучения функционирования мембранных ферментов сводится по существу к проблеме гетерогенного катализа. Эти ферменты находятся не в непрерывной гомогенной среде, а локализованы в биомембране, мицелле, везикуле или иной мембранной системе. Мембранные ферменты весьма чувствительны к локальному окружению, которое, вообще говоря, может существенно отличаться от окружения в растворе. Более того, для осуществления каталитической реакции фермент и мембраносвязанный субстрат должны находиться в одной и той же мембране или. везикуле, поэтому при анализе кинетических свойств мембранных ферментов часто возникают проблемы, связанные с их пространственным разделением. Рассмотрим некоторые положения, касающиеся кинетических аспектов работы мембранных ферментов как insitu, так и в модельных системах.

1. Пространственное разделение фермента и субстрата. Фермент и субстрат должны иметь возможность взаимодействовать. Предположим, что мы изучаем очищенный интегральный мембранный фермент в растворе детергента с неполярным липофильным субстратом. И фермент, и субстрат солюбилизированы в детергентных мицеллах, но для того, чтобы мог осуществляться катализ, они должны находиться в одних и тех же мицеллах. При избытке детергента увеличивается вероятность того, что фермент и субстрат будут находиться в разных мицеллах, и лимитирующей стадией в этом случае станет диффузия субстрата в ферментно-детергентные мицеллы. При этом скорость работы фермента зависит от поверхностной концентрации субстрата в мицелле, а не от объемной концентрации. При работе с очень гидрофобными субстратами часто возникает другая проблема. Такие субстраты могут не до конца солюбилизироваться в мицеллах или мембранных везикулах, часть их коагулирует с образованием комков или микроскопических кристаллов, в которые фермент не проникает. Небольшое число ферментов может работать в вывернутых мицеллах, когда содержащие воду структуры диспергированы в органическом растворителе, но это скорее исключение, чем правило.

Иные проблемы при измерении активности мембранных ферментов возникают, когда либо фермент, либо субстрат находится как в мембраносвязанной, так и в растворенной формах. Примерами такого рода служат "поверхностные" ферменты - липазы или факторы свертывания крови. Для анализа кинетики таких систем необходимо знать соотношение между формами фермента в данных экспериментальных условиях и каталитические активности каждой из форм. Во всех этих случаях смысл величин максимальной скорости и константы Михаэлиса может быть совершенно иным, чем для ферментов, активность которых измеряется в гомогенной среде, что сильно осложняет интерпретацию этих параметров.

Гьстерезис и гетерогенность. Мембранные ферменты обладают и другими особенностями, затрудняющими интерпретацию кинетических данных. Эти особенности связаны с солюбилизацией. Каталитическая активность мембранных ферментов часто очень сильно зависит от используемого детергента или фосфолипида. Обычно активность мембранных ферментов измеряют в смеси, содержащей детергент и экзогенно добавленный фосфолипид. Кроме того, ферментный препарат нередко содержит соочищаемые с ним эндогенные липиды. В таких условиях физическое состояние фермента, в частности степень его агрегации, оказывается весьма неопределенным и скорее всего гетерогенным. Часто в одной и той же среде, компоненты которой смешивались в разной последовательности, получают совершенно разные ферментативные активности. Такая зависимость от предыстории препарата являет собой пример гистерезиса и весьма типична для мембранных ферментов. По существу фермент "застревает" в метастабильном состоянии и не может приобрести наиболее стабильную "рабочую конформацию". Например, простое смешивание солюбилизированного мембранного белка с фосфолипидными великулами скорее всего не приведет к встраиванию белка в липосомы. Для достижения успешной реконструкции разработаны специальные процедуры, позволяющие избежать перехода системы в нежелательное метастабильное состояние. В качестве примера фермента, образующего крупные агрегаты, можно привести бактопренолкиназу, очень гидрофобный белок из Staphylococcusaureus. Его активность не зависит от степени агрегации, что встречается далеко не всегда.