Итак, далее в буферном растворе смешивают две ДНК, — плазмиды и вставки, — и выдерживают их при оптимальной температуре «гибридизации». Чужеродная ДНК «встраивается» в ДНК плазмиды, хотя и может превышать ее по длине, т. е. достигать размера в несколько тысяч пар оснований. Окончательное слияние, «приживание» новой ДНК, разумеется, обеспечивают ДНК-лигазы.
Я употребил термин «гибридизация». Что он обозначает в данном случае? Условимся называть так образование двухнитевой структуры в результате контакта двух комплементарных однонитевых последовательностей нуклеотидов, типа ДНК-ДНК или ДНК-РНК. Термин «комплементарные» нам уже знаком. Последовательности могут быть одинаковой длины, тогда образуется сплошь двухнитевой «гибрид». А могут быть и существенно различными по длине. В этом случае образуется «участок гибридизации», соответствующий длине более короткого из двух партнеров. Минимальная длина участка гибридизации, при которой он достаточно устойчив, — это 8-10 пар нуклеотидов. Впрочем, для устойчивой гибридизации комплементарных липких концов двух молекул ДНК эту цифру можно уменьшить вдвое, так как двунитевые структуры самих ДНК будут поддерживать новообразованный короткий участок гибридизации.
Может возникнуть вопрос: а почему сама разрезанная плаз-мида не восстанавливает кольцевую структуру путем гибридизации своих собственных липких концов? Ну, во-первых для сравнительно короткой ДНК плазмиды не так-то просто, распрямившись, самопроизвольно снова свернуться в кольцо. Во-вторых, встраиваемый фрагмент ДНК берется в большом избытке с тем, чтобы процесс встраивания в плазмиду имел конкурентное преимущество по отношению к процессу восстановления плазмиды. С этой же целью 5'-фосфатные группы из места разреза плазмиды убирают действием еще одного фермента — «щелочной фосфата-зы». Поначалу достаточно, чтобы соединилась одна пара липких концов, принадлежащих плазмиде и встраиваемой ДНК. Со временем, непременно, благодаря тепловым движениям соединится и вторая пара.
И все-таки поставленный вопрос не напрасен. Полностью избежать «реставрации» пустых плазмид, действительно, не удается. К счастью найден способ различать среди колоний бактерий, выросших на среде с антибиотиком, те, которые приютили « пустую « плазмиду от тех, что получили плазмиды со встроенным фрагментом чужой ДНК. Способ этот очень красив. Идея его такова. Некоторая модификация самой плазмиды позволяет ей в «сотрудничестве» с основным геномом бактерии E.coli в присутствии некоего хромогенного субстрата (похожего на лактозу) синтезировать продукт голубого цвета. В результате на чашке с агаром вырастают голубые колонии бактерий. Вставку же чужеродного фрагмента ДНК производят б таком месте, что плазмида утрачивает способность к «сотрудничеству». В результате чего вырастают колонии белого цвета. Их-то и отбирают, чтобы уже в большом объеме жидкой питательной среды наращивать бактериальную массу с плазмидами и чужеродной ДНК. Таким образом решается задача умножения количества («клонирования») интересующей нас ДНК.
Замечу попутно, что описанным выше способом в плазмиду можно вставить так называемый «поликлоновый сайт». Это — синтезированная химически последовательность в несколько десятков пар нуклеотидов, подобранная таким образом, что в ней содержатся сайты узнавания доброй дюжины различных рестрик-таз. Это существенно расширяет возможности эксперимента.
Некоторые приемы экспериментальной микробиологии
Мне только что пришлось использовать термины: «чашка с агаром», «колонии бактерий». Поскольку специализация в области молекулярной биологии требует понимания методов и хорошего владения приемами микробиологии, следует пояснить о чем идет речь.
Когда для лабораторных нужд наращивают значительное количество бактерий, это делают в больших колбах, наполненных жидкой питательной средой. Такие среды готовят и продают в сухом виде специализирующиеся на этом фирмы. Для сохранения доступа воздуха колбы закрывают ватными тампонами (обернутыми в марлю) и стерилизуют в автоклаве. После «инокуляции» — внесения в них малой порции бактерий колбы выдерживают в «теплой комнате», где поддерживается температура 37°С, в течение ночи. При этом их устанавливают на механической качалке ради улучшения аэрации. За ночь среда становится мутной — такое в ней нарастает количество бактерий. Их нетрудно собрать центрифугированием. В микробиологической промышленности в огромных стальных ферментерах с принудительной аэрацией наращивают тонны (1) бактерий. Затем из них выделяют вещества, используемые в качестве пищевых добавок к корму скота или в фармакологии.
Если же стоит задача отобрать в лаборатории бактерии, отличающиеся определенными свойствами (например, устойчивостью к действию антибиотиков) поступают прямо противоположным образом. Следят за нарастанием потомства единичных бактерий. Для этого используют особое вещество — агар. Его выделяют из определенного вида морских водорослей. Уже смешанный с питательной средой «бакто-агар» поставляется в высушенном виде. Его растворяют в горячей воде, стерилизуют в автоклаве и разливают в стерильные «чашки Петри». Это — круглые, плоскодонные пластмассовые чашки диаметром в 9 и высотой в 1 сантиметр с крышками. Бактоагар застывает в виде очень пористой твердой массы, поры которой заполнены питательным бульоном.
Исследуемую популяцию бактерий многократно разбавляют с таким расчетом, чтобы в 2-3-х миллилитрах суспензии, которые выливают на поверхность агара, содержалось лишь порядка сотни бактерий. Они случайным образом распределяются по поверхности агара. Далее закрытые чашки на 12—14 часов оставляют в теплой комнате. (Перевернув, для того чтобы питательный бульон притекал к поверхности агара.) Каждая бактерия дает многочисленное потомство, которое хорошо видно глазом. Это и есть «колонии» бактерий. Начальное разбавление и время инкубации выбирают так, чтобы колонии не сливались друг с другом.
Остается добавить, что при всех описанных операциях выполняются требования строгой стерильности. Инокуляцию колб с питательной средой, разлив бакто-агара в чашки, разбавление суспензий бактерий и нанесение пробных аликвотов на агар производятся в специальном, так называемом «ламинарном» застекленном шкафу. Через который непрерывно, в направлении из шкафа в комнату прокачивается стерилизованный прохождением через фильтр воздух.
Литература
1 Довгяло О.П., Федоренко Н.М. Ишемическая болезнь сердца. - М.: Медицина, -1986.
2 Долгов В.В. Морфо-функциональная характеристика эндотелия сосудистой стенки в норме и при атеросклерозе. Автореф. Док. дис. - М. -1985.
3 Долгушин И.И., Зурочка А.В., Чукичев А.В., Колесников А.Л. Роль нейтрофилов в регуляции иммунной реактивности и репаративных реакций повреждения ткани. // Вестник Росс. Акад. мед.наук.-2000. N 2. -C.-14-19.