Получение мембранного белка бактериородопсина, меченного дейтерием по остаткам ароматических аминокислот L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана (стр. 1 из 3)

.

@2006 г. О.В. МОСИН

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, Москва, проспект Вернадского, д. 86.

Биосинтетически получены препараты мембранного белка бактериородопсина, в которых природные ароматические аминокислоты L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан селективно замещены на их дейтерий-меченные аналоги. Это достигается путем культивирования штамма галофильных бактерий Halobacterium halobium ЕТ 1001 на синтетической среде, содержащей вместо природных аминокислот химически синтезированные L-[2,3,4,5,6-2 H5 ]-фенилаланин, L-[3,5-2 H2 ]-тирозин и L-[2,4,5,6,7-2 H5 ]-триптофан. Представлены данные по культивированию H. halobium ЕТ 1001 на средах, содержащих дейтерий-меченные аналоги ароматических аминокислот и выделению дейтерий-меченного бактериородопсина. Анализ степени дейтерированности аминокислот гидролизатов бактериородопсина проводили методом масс-спектрометрии электронного удара после препаративного разделения их методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в виде метиловых эфиров дансил-аминокислот и бензилоксикарбонильных производных аминокислот. Показано, что в масс-спектрах производных аминокислот гидролизатов бактериородопсина присутствуют молекулярные ионы, которые соответствуют ароматическим дейтерий-меченным аминокислотам и практически отсутствуют их нативные немеченные аналоги. Полученные данные свидетельствуют о высокой эффективности мечения бактериородопсина в этих условиях.

ВВЕДЕНИЕ.

Ретинальсодержащий белок - бактериородопсин, выполняющий функции АТФ-зависимой транслоказы в клеточной мембране галофильных бактерий Halobacterium halobium , был выделен и детально проанализирован Остерхельтом в 1970 году [1]. Несмотря на то, что бактериородопсин в настоящее время довольно хорошо изучен, он все еще остается в центре внимания исследователей по целому ряду причин. Прежде всего, благодаря своей высокой светочувствительности и разрешающей способности, он широко используется в прикладных целях как биологический фотохромный материал [2]. Кроме этого, бактериородопсин весьма привлекателен, как модельный объект для исследований, связанных с изучением функциональной активности и структурных свойств мембранных белков в составе нативных энергопреобразующих мембран.

Компьютерная модель мембранного белка бактериородопсина из H. halobium

Для получения детальной информации о структуре полипептидной цепи мембранного белка в нативной мембране целесообразно селективно вводить в белок изотопные метки, которые позволяют использовать спектральные методы высокого разрешения, такие как спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [3], Раман и лазерная спектроскопия [4,5], инфракрасная (ИК) спектрометрия [6] и масс-спектрометрия (МС) [7]. В связи с этим особенно перспективны исследования с мембранными белками, селективно обогащенными стабильными изотопами, например, дейтерием по остаткам таких функционально важных аминокислот, как L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан [8,9]. Это связано с тем, что указанные аминокислоты участвуют в процессе формировании хромофорного центра бактериородопсина и в его функционировании [10]. Поэтому важно получать подобные модифицированные дейтерием белки в очищенном виде и в препаративных количествах.

Целью настоящей работы было получение препаратов бактериородопсина, селективно меченных дейтерием по остаткам ароматических аминокислот - L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана, а также масс-спектрометрический анализ дейтерий-меченных аминокислот в составе гидролизатов бактериородопсина после их препаративного разделения методами обращенно- фазовой высокоэффективной хроматографии (ВЭЖХ) в виде метиловых эфиров дансил-аминокислот и бензилоксикарбонильных производных аминокислот.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА .

В работе использовали соли квалификации “х.ч”., DL-аминокислоты (Reanal, Венгрия), аденозин-и уридин-5-монофосфаты (Sigma, США.), панкреотическую телячью дезоксирибонуклеазу 1 (Fluka Chemie AG, Швейцария), додецилсульфат натрия (ДСН) (Chemapol, Чехо-Словакия). L-[2,3,4,5,6-2 H5 ]-фенилаланин (90 ат.% 2 Н), L-[3,5-2 H2 ]-тирозин (96 ат.% 2 Н) и L-[2,4,5,6,7-2 H5 ]-триптофан (98 ат.% 2 Н) (способы получения указаны в работах [ 11,12]), были предоставлены доц. кафедры биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова к.х.н. А.Б. Пшеничниковой. Для получения производных аминокислот использовали N-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (дансилхлорид) (Sigma, США), карбобензоксихлорид (Войковский химзавод, РФ) и диазометан. Диазометан получали из N-нитрозометилмочевины (Merck, Германия).

Бактериальные штаммы и питательные среды . Объектом исследования служил пигментированный штамм галофильных бактерий Halobacterium halobium ЕТ 1001. Штамм был получен из коллекции культур микроорганизмов Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Штамм поддерживали на пептоновой среде с 2%-ным агаром [13].

Для получения немеченного бактериородопсина использовали синтетическую среду, содержащую 18 аминокислот (количества компонентов приведены в г/л): (DL-аланин 0,43, L-аргинин 0,4, DL-аспарагиновая кислота 0,45, L-цистеин 0,05, L-глутаминовая кислота 1,3, L-глицин 0,06, DL-гистидин 0,3, DL-изолейцин 0,44, L-лейцин 0,8, L-лизин 0,85, DL-метионин 0,37, DL-фенилаланин 0,26, L-пролин 0,05, DL-серин 0,61, DL-треонин 0,5, L-тирозин 0,2, DL-триптофан 0,5, DL-валин 1), нуклеотиды (аденозин-5-монофосфат 0,1, уридин-5 монофосфат 0,1), соли (NaCl 250, MgSO4 7H2 O 20, KСl 2, NH4 Cl 0,5, KNO3 0,1, KH2 PO4 0,05, K2 HPO4 0,05, цитрат натрия 0,5, MnSO4 H2 O 3 10-4 , CaCL2 6H2 O 0,065, ZnSO4 7H2 O 4 10-5 , FeSO4 7H2 O 5 10-4 , CuSO4 5H2 O 5 10-5 ), глицерин 1, ростовые факторы (биотин 0,1 10-3 , фолиевая кислота 10 10-3 , витамин В12 0,02 10-3 ).

В экспериментах по введению дейтериевой метки в бактериородопсин вместо L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана в синтетическую среду добавляли их дейтерированные аналоги - L-[2,3,4,5,6-2 H5 ]-фенилаланин, L-[3,5-2 H2 ]-тирозин, и L-[2,4,5,6,7-2 H5 ]-триптофан.

Среды стерилизовали при 0,5 ати в течении 30-40 мин, рН доводили до величины 6,5-6,7 при помощи KOH. Посевной материал выращивали в колбах Эрленмейера, объемом 250 мл (с наполнением средой до 50 мл) при 35-37 0 С в условиях интенсивной аэрации и освещении лампами дневного света ЛДС-40. После суток посевной материал в количестве 5-10 % переносили в синтетическую среду, содержащую дейтерий-меченные аналоги ароматических аминокислот и культивировали в течении 4-5 суток как и при получении посевного материала.

Выделение фракции пурпурных мембран . Клетки осаждали на центрифуге Т-24 (Германия) (10000 об/мин, 10 мин.), осадок клеток суспендировали в дист. воде, экспонировали ультразвуком (3 экспозиции продолжительностью 5 мин) и вновь центрифугировали (10 000 об/мин, 10 мин). Пигменты удаляли обработкой ацетоном, липиды экстрагировали смесью хлороформ-метанол (2:1), растворитель декантировали. Полученный осадок клеток (100-150 мг) суспендировали в 100 мл буфера трис-HCL (рН 7,5), добавляли 1 мг дезоксирибонуклеазы 1 и инкубировали в течении 5-6 часов при 37 0 С, затем разбавляли дист. водой до 200 мл, после чего инкубировали 15 часов при 40 С. Осадок промывали водой с последующим отделением растворителя до получения бесцветных промывных вод. Контроль чистоты полученной суспензии пурпурных мембран (в Н2 О) проводили на спектрофотометре “Beckman DU-6” (США) по соотношению полос поглощения при 280 нм/568 нм (e280 =1,1 10 5 М-1 см-1 [14] и e568 =6,3 104 М-1 см-1 [15]).

Выделение бактериородопсина . Препараты пурпурных мембран (50 мг) солюбилизировали в 2 мл 0,5%-ного раствора додецилсульфата натрия (ДСН) в Н2 О, выдерживали в течении 8-10 часов при 220 С, затем центрифугировали (7000 об/мин, 5 мин). Осадок отделяли, к супернатанту добавляли 5-ти кратный избыток метанола, выдерживали при 00 С в течении 12-14 часов и центрифугировали (13000 об/мин, 10 мин). Остатки ДСН удаляли, промывая осадок белка дист. водой. Выход бактериородопсина составил 20 мг.

Гидролиз бактериородопсина . Гидролиз бактериородопсина проводили двумя методами: (А)-кислотным и (В)-щелочным гидролизом. Для этого белок делили на две равные порции по 10 мг и гидролизовали в запаянных стеклянных ампулах в 30-ти кратном избытке гидролизирующего агента (24 ч, 1100 С): (А)- в 6 н. 2 НCL (в 2 Н2 O ) с 3%-ным (по весу) фенолом и в (В) - 4 н. Ba(OH)2 . После этого гидролизат, полученный в условиях (А) упаривали в роторном испарителе при 400 С. Остатки дейтеро-соляной кислоты удаляли путем выдерживания в эксикаторе над твердым NaOH. После проведения гидролиза (В), реакционную смесь суспендировали в одном объёме горячей дистиллированной воды и нейтрализовали 2 н. раствором H2 SO4 до рН 7,0. Выпавший осадок сульфата бария отделяли центрифугированием (10000 об/мин, 5 мин), супернатант декантировали и упаривали в роторном испарителе при 400 С. Гидролизаты бактериородопсина, полученные в условиях (А) и (В), высушенные до постоянной массы, обрабатывали дансилхлоридом и диазометаном (или карбобензоксихлоридом).

Получение дансиламинокислот гидролизатов бактериородопсина . К 10 мг высушенных гидролизатов бактериородопсина в 2 мл 2 м. NaHCO3 (2 10-4 моль) рН 9-10 дробными порциями при перемешивании добавляли 16 мг (5,9 10-5 моль) дансилхлорида в 4 мл ацетона. Реакционную смесь выдерживали при перемешивании при 400 С в течении часа, затем подкисляли 2 н. раствором HCL до рН 3 и экстрагировали этилацетатом (3 раза по 5 мл.). Объединенный экстракт промывали дист. водой до значения рН 7,0, сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст.