Смекни!
smekni.com

Получение трансгенных животных (стр. 4 из 5)

Год Событие Автор
1971 Доставка чужеродной ДНК в ооциты кролика сперматозоидами Bracket
1974 Получение трансгенных мышей с помощью вирусных векторов Jaenish, Mintz
1976 Передача трансгена по наследству Jaenish
1980 Получение трансгенных мышей микроинъекцией Gordon
1981 Получение стволовых клеток Ewans, Kaufman, Martin
1984 Эмбриональные химеры из клеток тератокарциномы Bradley
1985 Получение трансгенных сельскохозяйственных животных Brem, Hammer
1986 Эмбриональные химеры с использованием ЭСКПолучение овец посредством пересадки ядер Gossler,Willadsen
1987 Гомологичная рекомбинация в ЭСКПолучение КРС методом пересадки ядер Thomas, CapecchaBrather
1988 Получение кроликов методом пересадки ядер Slice и Robl
1989 Генный таргетинг у мышейПолучение трансгенных мышей и свиней с помощью спермиев в качестве векторов Получение трансгенного КРС методом микроинъекцииПолучение свиней методом пересадки ядер Thompson el al.,Lavitrano el at.,Gandolfi et al.Roschlau el al., Prather et al.,
1995 Получение трансгенного КРС с помощью спермиев Schelander et al
1996 Получение овец методом пересадки ядер культивируемых эмбриональных клетокПолучение ЭСК приматов CampbellThomson
1997 Получение овец методом пересадки ядер фетальных клеток и соматических клеток взрослого животногоПолучение трансгенных овец методом пересадки ядер трансформированных культивируемых клетокПолучение химерных трансгенных свиней, с использованием ПЗК Wilmutetal,SchniekePiedrahita
1998 Получение трансгенного КРС методом пересадки ядер трансформированных фетальных фибробластовПолучение трансгенного КРС с использованием псевдотипных ретровирусных векторов Получение ЭСК из бластоцист человека Получение мышей методом инъекции в цитоплазму ядер кумулюсных клетокПолучение КРС методом пересадки ядер дифференцированных клеток CibelliChanThomsonWakayamaKato
1999 Получение трансгенных мышей методом коинъекции ооцитов спермиями и экзогенной ДНК Perry
2000 Получение свиней методом пересадки ядер соматических клеток (клетки гранулезы) Polejaeva

2. ФАКТОРЫ ПОВЫШЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ТРАНСГЕНОВ В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ

Наряду с низкой эффективностью большинства методов трансгенеза основным лимитирующим фактором получения трансгенных является случайный характер интеграции трансгена в геном. На экспрессию трансгена в организме животных оказывают влияние последовательности, прилегающие кв участку интеграции, что является причиной большой вариабельности уровня экспрессии. Уровень синтеза трангенного продукта может варьировать у различных животных от эктопного до слабого или даже находится ниже порога детекции.

Влияние участка интеграции на уровень и характер экспрессии объясняется так называемым позиционным эффектом [Wilson era/., 1990, Sippel et al., 1997). Кроме того, ограниченные знания регуляторных последовательностей большинства генов приводят к использованию зачастую полностью не охарактеризованных геномных фрагментов, что и является причиной низкой эффективности экспрессии в экспериментах по переносу генов [Palmlter, Brinster, 1986].

Для того чтобы преодолеть позиционный эффект и таким образом увеличить вероятность оптимальной экспрессии трансгенов, интегированных в случайной локализации, был применен целый ряд различных стратегий.

Первым таким подходом, позволившим увеличить уровень экспрессии, являлось введение в генные конструкции гомологичных интронных последовательностей.

Положительное влияние на уровень экспрессии трансгенов оказывало введение в генные конструкции S/MAR-элементов

Наиболее удачным решением проблемы преодоления позиционного эффекта явилось интеграция в определенный участок генома посредством гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках, так как это обеспечивает контроль трансгенной конструкции всеми регуляторными последовательностями, присутствующими в выбранном эндогенном локусе. Оптимальная локализация трансгенов в геноме клетки хозяина может быть выбрана исходя из уровня и характера экспрессии экспериментального трансгена. Еще одним подходом, позволившим дайной интеграции трансгена в геном хозяина является включение в генные конструкции всех регуляторных элементов, ответственных за его экспрессию. Стандартные плазмидные, космидные или фаговые векторы в большинстве случаев не могут быть использованы, вследствие их ограниченной емкости. Данная стратегия может быть использована с применением векторов типа искусственных хромосом, обладающих повышенной клонирующей способностью.

Наиболее широкое применение для получения трансгенных животных нашли векторные системы на основе YAC (обзоры Montoliuetal. 1993, Jakobovits, 1994, Peterson, 1997, Peterson etal 1997) YAC- эукариотические клонирующие векторы, способные к стабильному сохранению геномных фрагментов ДНК длиной более 1 миллиона п.о. [Burke., 1987]. Они представляют собой линейные фрагменты ДНК, содержащие все необходимые элементы для их сохранения в клетках дрожжей в виде искусственных хромосом. Первые результаты успешного использования YACs в экспериментах по трансгенезу на мышах были получены в 1993 году [Jakobovits et a/., 1993, Schedl et a/., 1993, Strauss etal., 1993].

Для введения YACs в эмбрионы мышей нашли применение три различных подхода: пронуклеарная микроинъекция очищенной в геле YAC-ДНК [Schedl et a/., 1993], липофекция YAC-ДНК в эмбриональные стволовые клетки [Strauss et a/., 1993] и слияние дрожжевого сферобласта с эмбриональными стволовыми клетками [AtoboWte ef a/., 1993). Исследование экспрессии YACs у различных линий трансгенных мышей выявило зависимость уровня экспрессии от числа копии трансгена. С другой стороны, уровень экспрессии не зависел от позиционного эффекта

В то время, как YAC-технологии широко используются для получения трансгенных мышей [обзоры Peterson et al., 1997, Giraldo and Montoliu, 2001) Несколько исселдователай сообщили об успешном создании YAC-трансгенных сельскохозяйственных животных. Были получены свиньи и крысы посредством ксенотрансплатации и направленной экспрессией рекомбинантных генов в молоко трансгенных животных.

Результаты получения трансгенных животных с использованием YAC.

Вид животных Трансген Размер Цель Авторы
кролик Тирозиназа мыши 250 Идентификациярегуляторныхпоследовательностей Montoliu, 1996Brem, 1996
Кролик Аполипопротеин человека 108 Анализ структуры Rouy, 1998
Свинья MCP, CD59, CD46 человека 420 Ксенотрансплантация Yanoutsos,Langford, 1996

что число молекул YAC, микроинъецируемых в пронуклеус зигот значительно меньше, чем при использовании плазмидных конструкций (это обусловлено большим размером YAC), общая эффективность получения трансгенных сельскохозяйственных животных с использованием векторов на основе УАС практически не отличается от результатов, полученных с использованием стандартных генных конструкций. Так, Brem с соавторами [1996\, используя концентрации YAC-ДНК 1-4 нг/мкл, получили 7,4% трансгенных кроликов, что соответствовало общей эффективности 0,74%. Roue с соавторами инъецировали в пронуклеус зигот кроликов раствор YAC в концентрации 1 нг/мкл и достигли степени интеграции 11,8% при общей эффективности 0,71%. Таким образом, размер инъецируемой ДНК не оказывал существенного влияния на эффективность получения трансгенных животных.

Было установлено, что при микроинъекции YAC в пронуклеос зигот животных часто происходит интеграция в геном только части молекулы. Причиной может быть механическое повреждение молекул ДНК большой длины в ходе приготовления раствора ДНК и микроинъекции в пронуклеос. Чтобы прекратить повреждение добавляют полиамины, которые формируют комплексы с ДНК и стабилизируют ее посредством образования компактных структур.

Не смотря на огромные преимущества векторов на основе YAC , они имеют ряд недостатков, выражающихся в определенных трудностях лри создании и подготовке YAC-конструкций. К ним относятся химеризм инсерции (более 50% клонов в YAC библиотеке), нестабильность инсерции, перестройки и потенциальная контаминация эндогенными дрожжевыми хромосомами, что затрудняет их эффективную очистку. С целью исключения таких проблем были созданы другие типы векторов на основе искусственных хромосом, такие как клоны Р1-фага, BAC – "bacterialartificialchromosome", PAC – "P1 bakteriophage-derivedartificialchromosome".

Клонирующая система бактериофага Р1 может эффективно сохранять инсерции гетерологичной ДНК размером 70-100 т.п.о. [Stemberg, 1999].

Наряду с YACs BACs используются для выполнения широкого спектра фундаментальных исследований, включающего изучение мутаций, исследование функции и действия генов in vivo, идентификация и анализ регулярных последовательностей, находящихся на значительном удалении от структурного гена. Потенциальные возможности BACs нашли также применение для повышенной экспрессии рекомбинантных белков в молочной железе трансгенных животных [Stinnakre et al., 1999, Zuelke, 1998].

3. ПЕРСПЕКТИВЫ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ РАБОТ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ

Развитие биотехнологии сельскохозяйственных животных, в том числе генная инженерия, открывает новые возможности развития животноводства. Уже имеющиеся результаты по получению трансгенных животных говорят о возможности изменения ряда важнейших хозяйственно-ценных признаков. Например, трансгенные животные (свиньи, куры, кролики) с геном гормона роста при равных условиях характеризуются повышенными темпами роста.