ЯМР-спектроскопия нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов (стр. 2 из 3)
4. Определение структуры полисахаридов
Химический анализ полисахаридов достаточно сложен, поэтому многие исследования сахаридов направлены на определение их химической структуры. Кольцо молекулы сахаридов может принимать различные конформации: наиболее часто встречающиеся среди них – кресло и ванна. Обе конформации характеризуются типичными значениями констант косвенного спин-спинового взаимодействия и могут достаточно просто определяться с помощью ЯМР Н. В обеих конформациях расстояния между отдельными кольцевыми протонами также будут различать совершенно определенным образом. Следовательно, и данные по ЯЭО также должны существенно отличаться. В противоположность тому, что было получено при рутинном поста-дийном определении структуры протеинов, в химии сахаридов отсутствуют простые методы последовательного определения структуры.
Для полного описания структуры необходимо знать не только картину связей моносахаридов, но и характер их связывания, т.е. необходимо дополнительно определить то, какой является связь: CL- или /3‑гликозидной. Здесь самым надежным является метод двумерного ЯМР. Если же нас интересует только картина связей моносахаридов, то отнесение сигналов в спектрах может быть существенно упрощено в случае проведения процедуры дериватизации.
С точки зрения биологии значительный интерес представляет трехмерная структура полисахаридов, которая определяется конформацией кольцевых систем и вращением относительно простых связей в нециклических частях молекул. Принципиально структуру полисахаридов можно определить путем измерения констант связи и ЯЭО, хотя здесь могут возникнуть существенные трудности при оценке биологического соответствия определяемых структур. Связывание полисахаридов с липидами и протеинами, а также характер упаковки их в клеточные мембраны, по-видимому, оказывает сильное влияние на их пространственную структуру, так что измерения, проводимые в изолированных полисахаридах, даже при условии, что они проводятся в водной среде, необязательно должны давать реальное представление об интактной структуре. Но с другой стороны, такие измерения, по-видимому, дают наилучшее представление о структуре полисахаридов.
5. Исследование биологических мембран
Липиды образуют большой гетерогенный класс органических молекул, которые могут быть экстрагированы неполярными растворителями. Наряду с изолированными молекулами, такими, как жирорастворимые витамины и стероидные гормоны, для которых ЯМР успешно применяется для установления химической структуры, важны также фосфолипиды, которые образуют шюские, надмолекулярные структуры – двойные липидные мембраны. В соответствии с той ролью, которую играют мембраны, они были исчерпывающе исследованы с использованием всех имеющихся в распоряжении биофизических методов, включая ЯМР.
При исследовании мембран всегда имеют дело с большим числом молекул. Мембраны, встречающиеся в природе, представляют собой очень сложные системы, состоящие из большого числа различных липидов и протеинов, встроенных в липидную мембрану. В силу этого исключительно сложно получить детальное представление об индивидуальных молекулах подобно тому, как это было сделано для протеинов в растворах. Только для некоторых модельных систем, таких, как мицеллы и липосомы, которые состоят из вполне определенных компонентов, можно надеяться на то, что будут получены надежные ответы на принципиальные вопросы, касающиеся их организации и движения. В дальнейшем результаты, полученные для модельных мембран, могут быть перенесены на мембраны, встречающиеся в природе.
В зависимости от температуры и состава мембраны могут существовать в различных физических фазах. При понижении температуры мембраны обнаруживают свойства твердых тел, при повышении температуры они переходят в жидкокристаллическое состояние, которое характеризуется большей подвижностью молекул в плоскости мембраны. В жидкокристаллическом состоянии найдено, что коэффициенты латеральной диффузии почти так же высоки, как и в воде. Как правило, в таком состоянии находятся биологически активные мембраны при физиологических условиях. Ограничение движения в одной плоскости приводит к тому, что в спектрах ЯМР наблюдаются достаточно широкие линии, так как в данном случае изотропное движение невозможно.
Ниже температуры перехода ширина спектральных линий очень велика и составляет несколько миллионных долей, что соответствует значениям, наблюдаемым для спектров ЯМР в твердых телах.
Так как фосфолипиды содержат фосфатные группы, с помощью ЯМР 31С можно наблюдать фосфорсодержащие липосомы. Выше температуры фазового перехода при благоприятных условиях в искусственных мембранных везикулах можно наблюдать сигналы от различных фосфолипидов. В малых везикулах удается различить линии, соответствующие фосфолипидам, находящимся на внутренней и внешней сторонах мембраны. Для более надежного отнесения соответствующих резонансных линий фосфолипидов на внутреннюю или внешнюю поверхность мембраны, необходимо добавить парамагнитное вещество, для которого проницаемость мембраны невелика, и в основном будет наблюдаться связывание этого вещества с фосфолипидом, находящимся на одной из сторон поверхности. Резонансные линии липидов, связанных с парамагнитным веществом, в этом случае сильно уширяются и практически не наблюдаются в спектре. Спектры ЯМР 31Р липосом также являются подтверждением сделанного ранее вывода о том, что увеличение напряженности магнитного поля далеко не всегда обеспечивает более высокое разрешение, так как для ядер фосфора вклад в релаксацию за счет анизотропии химического сдвига будет значительным. В этом случае скорость релаксации возрастает как квадрат напряженности магнитного поля), а разность значений химических сдвигов увеличивается с ростом поля линейно, поэтому уширение линий может компенсировать возрастание разрешения.
По этой причине в рассмотренных выше системах для более сильных полей не удается различить сигналы от фосфолипидов, находящихся на внутренней и наружной сторонах мембраны. Конечно липиды, входящие в состав мембран, можно исследовать с помощью ЯМР *Н. В этом случае удается отдельно наблюдать сигналы от различных групп, входящих в состав липидов. По спектрам ЯМР 13Си'Н при условии, что изотопное замещение проводится по строго определенным положениям, удается селективно наблюдать атомы, находящиеся в длинных углеводородных цепочках.
Липидные мембраны обладают тем характерным свойством, что молекулы липидов определенным образом упорядочены. В одном из предельных случаев все молекулы полностью упорядочены, как в кристаллическом состоянии. Другим предельным случаем является статистический порядок, который в большей или меньшей степени наблюдается для жидкостей и порошкообразных сред. Для количественного описания степени упорядочения, называемого жидкокристаллическим, используется понятие параметра порядка. Эта величина является мерой макроскопического упорядочения некоторой величины в образце: например, упорядочения направления вектора, соединяющего два выделенных атома в молекуле, относительно некоторой оси. Параметр порядка может быть определен как величина, которая принимает значение, равное единице, если соответствующие величины, измеряемые в молекулах, являются одинаковыми для всех молекул, и значение, равное нулю, если эти величины принимают все возможные значения. На практике параметр порядка не всегда допускает такую простую и наглядную интерпретацию, а также не всегда удается установить непосредственную связь с величинами, которые могут быть измерены по спектрам.
Важные результаты, необходимые для установления структуры мембран, могут быть получены для ориентированных мембран с помощью резонанса на ядрах дейтерия. Ориентация создается следующим образом. Мембрану помещают между двумя тонкими стеклянными пластинами, каждая из которых задает ориентацию прилежащего слоя, т.е. получается двойной слой. При проведении экспериментов необходимо, прежде всего, решить проблему улучшения отношения сигнал/шум. Здесь существует достаточно простой вариант решения: для этого необходимо сложить несколько стеклянных пластинок с мембранами стопкой и получить спектр в таком образце. При наличии ориентации спектры мембран переходят из области резонанса, характерного для жидкости, когда вследствие изотропного движения большая часть взаимодействий полностью усредняется, в область резонанса, характерного для твердых тел. В ориентированных системах наблюдается расщепление резонансных линийБн,которое зависит от ориентации системы относительно внешнего магнитного поля и характеризуется константой квадрупольного взаимодействия, отличной от нуля для дейтерия, спин ядра которого равен единице. В жидкокристаллическом состоянии вращательная диффузия относительно оси, перпендикулярной поверхности мембраны, как правило, происходит с достаточно высокими скоростями, поэтому различия в спектрах, наблюдаемых для молекул, находящихся в этих плоскостях, усредняются до нуля. Величина квадрупольного расщепления ДV зависит от угляимежду направлением связи 13С – 2Н и нормалью к плоскости мембраны, а также от угла, который составляет эта нормаль по отношению к внешнему магнитному полю. Соответствующий параметр порядка определяется по следующей формуле:
