Реферат на тему:
Использование аффинной хроматографии
Твердым основанием для аффинной матрицы чаще всего служат хорошо известные нам 4% или 6% сефароза, иногда химически скрепленная (CL-сефароза), а в некоторых специальных случаях (см. ниже) и целлюлоза.
Имеется множество способов химической активации как самих матриц, так и удаленных от матрицы концов спейсеров. Такая активация необходима для обеспечения простоты "посадки" на них лиганда (в условиях биохимической лаборатории).
Здесь нецелесообразно рассматривать все это множество способов, тем более, что большинство из них требует более серьезного знания органической химии, чем дает средняя школа. (Интересующимся и лучше подготовленным читателям я могу рекомендовать свою книгу "Хроматография белков и нуклеиновых кислот" ("Наука", 1985)).
Тем не менее, для иллюстрации подхода к проблеме опишу в общих чертах один простейший и ранее других предложенный вариант (впрочем, используемый до сих пор).
В нем активация полисахаридной матрицы, несущей на себе множество свободных ОН-групп, производится путем обработки ее бромцианом (BrCN). В результате получают (в сильно щелочной среде) прочно сидящие на нитях сефарозы химически активные группы имидокарбоната, согласно реакции. Эти электрофильные группы "охотно" образуют ковалентные связи с нуклеофильными группами лиганда.
Так например, лиганд, имеющий свободную аминогруппу, может связаться с актированной таким образом матрицей через остаток изомочевины.
Возможны еще два варианта протекания этой реакции (с выделением аммиака), но оба они приводят к тому же конечному результату: лиганд (или спейсер с аминогруппой на конце) химически прочно связывается с матрицей.
Безусловным недостатком описанного метода активации матрицы следует назвать ядовитость бромциана и токсичность некоторых побочных продуктов реакции (в том числе и НВг), содержащихся в промывных водах после активации сефарозы.
В качестве спейсеров обычно используют либо 1,6 диаминогексан,, либо 6-аминокапроновую кислоту. Таким образом на свободном конце спейсера оказывается аминогруппа или карбоксил. Присоединение к нему лиганда также требует специальной химической реакции.
Поэтому фирма "Pharmacia" выпускает готовые матрицы, в которых спейсер (6-аминокапроновая кислота) активирован этерификацией концевого карбоксила N-оксисукцинимидом.
Присоединение лиганда по аминогруппе происходит в мягких условиях, в течение одного часа, что очень важно для лабильных лигандов. N-оксисукцинимид отщепляется и на его место надежной пептидной связью присоединяется лиганд.
Великое множество лигандов, описанных в научной литературе, можно разбить на две главных категории. Это лиганды с индивидуальной специфичностью и лиганды с групповой специфичностью, В качестве индивидуальных лигандов могут выступать ферменты, а также субстраты или ингибиторы соответствующих ферментативных реакций (для очистки ферментов).
Использование в целях очистки аффинной пары фермент-субстрат предполагает такие условия хроматографического процесса, когда фермент не может осуществить каталитический акт преобразования субстрата, а только связывается с ним в фермент-субстратный комплекс. (Например в отсутствие необходимого второго субстрата, соответствующих ионов или при неблагоприятном значении рН).
С другой стороны, важный раздел биохимии, особенно в прикладном аспекте, составляет конструирование обменников с закрепленными ферментами, на этот раз ведущими катализ в условиях, когда его продукты легко отделяются от ферментов.
Эти продукты вытекают из колонки или остаются в супернатанте после проведения ферментативной реакции в объеме взвеси, из которой матрица с закрепленным на ней ферментом затем удаляется в осадок.
Естественно, что в этих случаях в окружении иммобилизованного фермента создаются условия не только связывания субстрата, но и катализа соответствующей реакции.
Очевидное преимущество ферментов, закрепленных на хроматографической матрице, заключается в простой возможности многократного использования этих ферментов, поскольку они автоматически освобождаются из смеси с продуктами реакции.
Так же, как ферменты, белки-рецепторы могут служить лигандами для связывания и очистки гормонов и других низкомолекулярных эффекторов. Транспортные белки плазмы крови и белки - переносчики клеточных мембран - для очистки своих низкомолекулярных партнеров.
Белки - регуляторы и участники процессов матричного синтеза, используемые в качестве лигандов, позволяют решать задачи по вычленению регуляторных и других особых участков нуклеиновых кислот. То же относится к системам выработки и транспорта энергии.
Разумеется, все участники названных здесь биоспецифических пар могут меняться ролями - те, что были иммобилизованы, могут стать объектом аффинной очистки. Весьма продуктивным оказалось и создание иммуносорбентов, обладающих сродством к определенным антигенам.
Лиганды с групповой специфичностью обладают сродством к целой группе веществ. К примеру, "кофермент А" участвует во многих ферментативных реакциях. Закрепленный на аффинной матрице, он может обеспечивать очистку любого из соответствующих ферментов. В тех случаях, когда в исходном препарате имеется только один из них, очистка будет не хуже, чем при использовании лигандов с индивидуальной специфичностью. Иногда групповая специфичность некоторых опытным путем отобранных лигандов не имеет даже четкого объяснения этой их способности.
Например, кислый аминополисахарид гепарин (М>10 000) известен в качестве антикоагулянта крови. Но кроме того он нашел применение в биохимии как конкурентный ингибитор рибонуклеаз. Это его качество, по-видимому, отражает определенное сходство полимера с РНК.
Поэтому гепарин может быть использован в качестве лиганда для ряда белков, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами: полимераз, растриктаз, обратной транскриптазы, факторов инициации белкового синтеза и других.
В качестве лигандов могут выступать и сами нуклеиновые кислоты. Есть способы химического закрепления их на активированных матрицах.
Но чаще ДНК и РНК, используя их нитевую структуру, закрепляют на матрицах нековалентно: либо заплавляют в 4%-ную агарозу в процессе ее затвердевания из расплавленного состояния, либо "запутывают" между нитями набухшей в воде целлюлозы - при ее высыхании.
На отобранных путем клонирования и закрепленных в аффинной матрице фрагментах ДНК, содержащих определенный ген, можно задерживать и очищать соответствующую этому гену иРНК.
Синтезированную в лабораторных условиях полиуридиловую кислоту (поли У) длиной в сотню мономеров уридина можно ковалентно фиксировать на BrCN-активированной сефарозе.
Затем, благодаря наличию у большинства иРНК высших организмов более или менее длинного полиаденилового "хвоста", выделять суммарную фракцию иРНК из смеси со всеми остальными РНК клеточного лизата. Относительно короткие цепочки (10-20 нуклеотидов) олиго-дезокситимидиловой кислоты (олиго дТ) закрепляют через концевой 5'-фосфат на матрице волокнистой целлюлозы.
На таком лиганде можно так же, как в предыдущем случае, через хвостовую поли А закрепить определенную иРНК. Затем с помощью обратной транскриптазы, для которой олиго дТ будет служить праймером, синтезировать по этой иРНК двунитевую к ДНК, которая в этом случае остается связанной с матрицей и сама может выступать в качестве лиганда.
На этом ограничим перечень возможных лигандов, далеко не исчерпав их список, и в заключение краткого очерка аффинной хроматографии рассмотрим три простых примера: два с индивидуальной специфичностью и один - с групповой.
Пример 1. Очистка фермента карбоксипептидазы А из мышцы крысы (Bodwell, Meyer, 1981).
На BrCN-активированную сефарозу 4В сажали белковый ингибитор карбоксипептидазы А, выделенный из картофеля. Фракцию гомогената мышцы, экстрагированную между 0,4М КС1 и 2М NaCI в нейтральном буфере, дополнительно очищали осаждением сульфатом аммония и сажали на аффинную колонку с ингибитором, уравновешенную тем же 2М NaCI в нейтральном буфере, затем промывали таким же раствором. Элюцию фермента вели тоже 2М NaCI, но в 0,01М Na2CO3 при рН 11,2.
Отрыв фермента от ингибитора происходил за счет сильного защелачивания элюента. Примесные белки выходили при промывке, а фермент элюировался острым пиком после смены буфера
Эффективность очистки на этом этапе можно оценить сопоставляя площади под двумя пиками, обозначенными пунктиром.
Конечно же, мы не будем пытаться глубоко проникнуть в обширную область медицинской иммунологии. Коснемся только тех возможностей, которые использование иммунохимического подхода предоставляет для исследования биополимеров.
Однако для того, чтобы представить себе с чем мы будем иметь дело, необходимо, хотя бы поверхностно, познакомиться с механизмом выработки иммунитета, а также со специфическими клетками крови и молекулами его реализующими.
Широко распространенное понятие иммунитета до недавнего времени ограничивалось представлением о том, что речь идет о системе, обеспечивающей длительную неуязвимость человека для возбудителей болезней, которыми он однажды переболел хотя бы в самой легкой форме (прививка). Это тоже верно.
Но не будь у нас иммунной системы, то смертность от самых "пустяковых" на сегодняшний взгляд болезней была бы чудовищной. Человечество это по-настоящему поняло, когда столкнулось с вирусом СПИД, который атакует именно иммунную систему.
В наш организм из воздуха и пищи ежедневно проникают миллионы болезнетворных микробов и вирусов. Их всех встречает не знающее ни сна, ни отдыха "войско" иммунной защиты. Так что это за войско?