Известно, что адсорбция белков из раствора на твердой поверхности является результатом нескольких основных процессов [23]: а) электростатического взаимодействия между белком и поверхностью; б) взаимодействия между молекулами белков; в) изменения структуры белка. Таким образом, контакт белка с твердой поверхностью определяется как межмолекулярными, так и внутримолекулярными силами.
В процессе получения микрокапсул наносилось по 3 слоя каждого ПЭ, исходная концентрация ХТР составляла 5 мг/мл и 10 мг/мл. Анализ полученных результатов показал, что процент сорбции на 100 мг частиц при начальной концентрации 5 мг/мл составил 80% (4 мг/мл ХТР), 10 мг/мл – 41% (4,1 мг/мл ХТР). ? Включение ХТР в CaCO3 микрочастицы проводили методом адсорбции в порах (АП). О равномерном распределении фермента ....
2. Изучение активности иммобилизованного ХТР и биодеградации микрокапсул
Иммобилизованный в ПЭ микрокапсулы, ХТР практически полностью сохраняет свою активность (86±9% по сравнению с нативным ферментом).Данные, полученные в результате сравнения гидролиза субстрата нативным ХТР и ХТР, включенным в ПЭ микрокапсулы, представлены в виде графика на рисунке 3. Изменение оптической плотности во времени обусловлено накоплением продукта ферментативного гидролиза. Полученные данные позволяют сделать следующие выводы: а) в процессе гидролиза отсутствуют стерические затруднения при диффузии субстрата через оболочку к молекулам иммобилизованного ХТР; б) равномерное распределение фермента в частицах при адсорбции, способствует практически полному гидролизу субстрата молекулами ХТР; в) при иммобилизации не происходит изменения конформации активного центра молекул фермента.
Комлексообразование ферментов с ПЭ приводит к снижению активность или не оказывает влияния, которое зависит от природы реагирующих веществ и условий. Так, авторы работы [16] по иммобилизации лактатдегидрогеназы в сетку ПЭ комплекса, отмечают семикратное падение активности иммобилизованного фермента. В нашем случае, включение белков в ПЭ микрокапсулы, способствует сохранению их активности и получению стабильных при хранении препаратов.
С целью изучения проницаемости оболочек к действию протеолитических ферментов было исследовано влияние растворов ТР на ПЭ микрокапсулы. Как известно, ТР входит в состав секрета поджелудочной железы и является эндопептидазой, т.е. он расщепляет пептидные связи, образованные основными аминокислотами, такими, как лизин [24]. Были использованы следующие концентрации ТР: 0,05%, 0,1% и 0,2%. Результаты показали, что микрокапсулы растворились в течение часа (оптическая микроскопия). С целью доказательства сохранения активности ХТР, после биодеградации микрокапсул был проведен гидролиз субстрата полученными растворами. Спектрофотометрическое изучение показало, что ХТР сохранил активность после разрушения ТР. Результаты этого исследования представлены на рисунке 4. Прирост оптической плотности, обусловленный накоплением продукта ферментативного гидролиза, свидетельствует о сохранении активности ХТР после разрушения ПЭ микрокапсул.
Проведенные эксперименты позволяют сделать вывод, что в качестве исходной матрицы для получения ПЭ микрокапсул, содержащих ХТР, наиболее приемлемыми являются CaCO3 микрочастицы. Использование последних позволяет проводить процесс микрокапсулирования в физиологически оптимальных значениях рН на всех этапах. Это открывает большие возможности для иммобилизации широкого спектра белков с сохранением их активности. Кроме того, при растворении твердой CaCO3 матрицы, микросферы сохраняют размер и форму, что свидетельствует об их существенной прочности, в том числе по отношению к осмотическому давлению. Полученные микрочастицы с узким распределением по размерам (3-5 мкм) имеют пористую структуру, что позволяет иммобилизовать на их основе различные белки методоми физической сорбции. Высокое содержание по белку (80% в случае исходной концентрации ХТР 5 мг/мл), а также биосовместимость и биодеградация полученных ПЭ микросфер, позволяют использовать их в качестве систем доставки включенного препарата.
Экспериментальные данные, полученные при изучении активности иммобилизованного ХТР, свидетельствуют об отсутствии стерических затруднений при диффузии субстрата к молекулам фермента, равномерном распределении белка в частицах при адсорбции, сохранении конформации молекул фермента при иммобилизации. Результаты позволяют сделать вывод о сохранении активности и получении стабильных при хранении препаратов БАВ, включенных в ПЭ микрокапсулы.
Разрушение микрокапсул, полученных последовательной адсорбцией PLL и Alg на CaCO3 микрочастицах, под действием фермента поджелудочной железы – ТР, открывает широкие возможности использования полученных препаратов в медицинской биотехнологии. Использование природных и биодеградируемых ПЭ позволит создать микрокапсулы, обладающие такими свойствами, как избирательная проницаемость, контролируемая доставка и высвобождение заключенных в них БАВ, биодеградация, биосовместимость, что позволит расширить тем самым область их потенциального применения.
Полученные результаты будут использованы в дальнейшей работе по исследованию модели поведения микрокапсул при переходе через биологические барьеры для обеспечения адресной доставки БАВ к отдельным органам и клеткам- мишеням.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kraut J., (1967) Serine proteases: structure and mechanism of catalysis, Ann. Rev. Biochem, 242(24): 5777-5781.
2. Машковский М.Д,.(1993)Лекарственные средства, М., Медицина, 2: 685.
3. Arshady R., (1999) Microspheres. Microcapsules & Liposomes, London, 1.2.
4. Lvov Y.M., Sukhorukov G.B., (1997) Protein architecture: Assembly of ordered films by means alternated adsorption of opposite charged macromolecules, Membr. Cell. Biol., 11, 277-303.
5. Кабанов В.А., Зезин А.Б, (1984) Водорастворимые нестехиометричные полиэлектролитные комплексы - новый класс синтетических полиэлектролитов, Итоги науки и техники, М.,. Сер. Органическая химия, 5: 131-189.
6. Кабанов В.А, (1994) Физико-химические основы и перспективы применения растворимых интерполиэлектролитных комплексов, Высокомолекулярные соединения, 36(2): 183-197.
7. Mayya S., Schoeler B., Caruso F., (2003) Preparation and organization of nanoscale polyalactrolyte-coated gold nanoparticles, Adv. Funct. Mater., 13(3): 183-188.
8. Shenoy D.B., Antipov A.A., Sukhorukov G.B., Mohwald H., (2003) Layer-by-Layer Engineering of Biocompatible, Decomposable Core-Shell Structures, Biomacromolecules, 4(2): 265-272.
9. Qiu X.P., Leporatti S., Donath E., Mohwald H., (2001) Studies on the drug release properties of polysaccharide multilayers encapsulated ibuprofen microparticles, Langmuir, 17(17): 5375-5380.
10. Sukhorukov G.B., Donath E., Davis S., Lichtenfeld H., Caruso F., Popov V.I., Mohwald H., (1998) Stepwise polyalectrolyte assembly on particles surface: a novel approach to colloid design, Polym. Adv. Technol., 9 (10-11): 759-767.
11. Sukhorukov G.B., Donath E., Lichtenfeld H., Knippel E., Knippel M., Budde A., Mohwald H., (1998) Layer-by-Layer self assembly of polyelectrolytes on colloidal particles, Colloid. Surf.: Physicochem. Ang. Aspects, 137 (1-3): 253-266.
12. Antipov A.A., Shchukin D., Fedutik Y., Petrov A.I., Sukhorukov G.B., Mohwald H., (2003) Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication, Colloid. Surf.: Physicochem. Ang. Aspects, 224: 175-184.
13. Caruso F., Yang W.J., Trau D., Renneberg R., (2000) Microencapsulating of uncharged low molecular weight materials by polyelectrolyte multilayer self-assembly, Langmuir, 16(23): 8932-8936.
14. Antipov A.A., Sukhorukov G.B., Donath E., Mohwald H., (2001) Sustained release properties of polyelecyrolyte multiplayer capsules, J. Phys. Chem. B, 105(12): 2281-2284.
15. Donath E., Sukhorukov G.B., Mohwald H., (1999) Submicrometric and micrometric polyelectrolyte capsules, Nachrichten Aus Chemie Technik Und Laboratorium, 47(4): 400-405.
16. Бобрешова М, Сухоруков Г.Б., Сабурова Е.А., Елфимова Л.И., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. (1999) Лактатдегидрогеназа в интерполиэлектролитном комплексе. Функция и стабильность, Биофизика, 44(5): 813-820.
17. Trubetskoy V.S., Loomis A., Hangstrom J.E., Budker V.G., Wolff J.A., (1999) Layer-by-Layer deposition of oppositely charged polyelectrolytes on the surface of condensed DNA particles, Nucl. Acid Res., 27(15): 3090-3095.
18. Sukhorukov G.B., Donath E., Moy S., Susha A.S., (2000) Microencapsulation by means of step-wise adsorbtion of polyelectrolytes, Microencapsulation, 17(2): 177-185.
19. Berth G., Voigt A., Dautzenberg H., Donath E., Mohwald H., (2002) Polyelectrolyte complex and layer-by-layer capsules from chitosan/chitosan sulfate, Biomacromolecules, 3(3):579-590.
20. Balabushevitch N.G., Tiorina O.P., Volodkin D.V., Larionova N.I., Sukhorukov G.B., (2003) Loading the Multilayer Dextran Sulfate/ Protamine Microsized Capsules with Peroxidase, Biomacromolecules, 4(5): 1191-1197.
21. Volodkin D.V., Petrov A.I., Prevot M., Sukhorukov G.B., (2004) Matrix Polyelectrolyte Microcapsules: New System for Mocromolecule Encapsulation, Langmuir, 20: 3398-3406.
22. Gao C., Leporatti S., Moya S., Donath E., Mohwald H., (2001) Stability and Mechanical Properties of Polyelectrolyte Capsules Obtained by Stepwise Assembly of Poly(styrenesulfonate sodium salt) and Poly(diallyldimethyl ammonium )Chloride onto Melamine Resin Particles, Langmuir, 17: 3491-3495.
23. Haynes C.A., Norde W., (1994) Globular proteins at solid/liquid interfaces, Colloid Surf. B, 2: 517-566.
24. Кольиан Я., Рем К.-Г., (1998) Наглядная биохимия, М., Мир, 262-263.