Федеральное Государственное Образовательное Учреждение
Высшего Профессионального Образования
«Астраханский Государственный Технический Университет»
Кафедра Прикладной биологии и микробиологии
Курсовая работа
на тему: «Маслянокислые бактерии как продуценты кислот»
Астрахань 2007
Содержание
Введение
1. Особенности маслянокислого брожения
1.1. Механизм маслянокислого брожения
1.2. Бактерии, участвующие в маслянокислом брожении
1.3. Распространение маслянокислых бактерий
2. Объекты и методы исследования
3. Результаты исследования
Выводы
Список литературы
Введение
Маслянокислое брожение представляет собой процесс анаэробного разложения углеводов, пептонов, белков, жиров с образованием различных кислот, в том числе и масляной. Маслянокислые бактерии, осуществляющие данный процесс, играют главную роль в порче различных пищевых продуктов (сыра, сливочного масла, вина, уксуса). Основная роль масляной кислоты – это ее использование в промышленности с целью получения ацетона и бутанола при ацетонобутиловом брожении. Маслянокислое брожение используют также для получения масляной кислоты из крахмала. Масляную кислоту применяют в парфюмерии, она используется при мочке льна (Алешукина,2003).
Развиваясь в питательном субстрате, микроорганизмы вызывают сложные изменения органических веществ, в первую очередь углеводов. Превращения углеводов и некоторых других органических веществ в новые соединения посредством микроорганизмов называются брожениями (Родина,1963).
Целью настоящей работы явилось выделение из почвы маслянокислых бактерий – продуцентов масляной кислоты.
В задачи данного исследования входило:
1. Выделение маслянокислых бактерий садовой городской почвы г. Астрахани и изучение их морфологических свойств.
2. Выделение маслянокислых бактерий из модельной экосистемы и сравнение микробиологического состава садовой почвы, и почвы, изъятой из модельной системы при моделировании подтопления территорий в связи с поднятием уровня Каспийского моря.
1. Особенности маслянокислого брожения
1.1 Механизм маслянокислого брожения
Маслянокислое брожение представляет собой вариант решения донор - акцепторной проблемы на базе гликолитически образованного пирувата. Новое в маслянокислом брожении - возникновение реакций конденсации типа С2+С2 → С4, в результате чего образуется С4- акцепторная кислота. Судьба этой кислоты различна и определяется необходимостью акцептирования водорода с НАД-Н2, освобождающегося в процессе брожения, а это в свою очередь тесно связано с оттоком водорода на конструктивные процессы. В качестве конечных С4- продуктов в процессе брожения возникают соединения различной степени восстановления. Характерным С4- продуктом является масляная кислота. Осуществляют такой тип брожения многие бактерии, относящиеся к роду Clostridium. Типичными представителями клостридиев, осуществляющих маслянокислое брожение, являются C. butyricum и C. pasteurianum. Они сбраживают сахара с образованием масляной и уксусной кислот, СО2 и Н2О. Превращение глюкозы до пирувата осуществляется по гликолитическому пути. Следующая реакция- разложение пирувата до ацетил - КоА и СО2. , сопровождающееся образованием восстановленного ферредоксина (ФД). Реакция катализируется ферментом пируват: ферредоксиноксидоредуктазой и является ключевой в маслянокислом брожении. Особенности реакции - участие в ней белков, содержащих негемовое железо и кислотолабильную серу (FeS-белки).
Обнаруженный у C. pasteurianum рубредоксин имеет окислительно- восстановительный потенциал около -57 мВ и участвует в реакциях одноэлектронного переноса, в основе которого лежит переход железа: Fe2+ - Fe3+.
Клостридии содержат ферредоксины с 1-2 центрами Fe4S4 типа и молекулярной массой 6000-7000 Да.
Ферредоксины играют центральную роль в метаболизме клостридий, сопрягая катаболические процессы с биосинтетическими реакциями. Объясняется это тем, что у клостридий (как и других анаэробов) физиологические реакции в клетке всегда протекают при отрицательных окислительно-восстановительных потенциалах. В этих условиях белки, имеющие общий отрицательный окислительно-восстановительный потенциал, особенно пригодны для функционирования в составе ферментов и в качестве переносчиков электронов.
Дальнейшее превращение заключается в отщеплении от молекулы 3- оксибутирил-КоА молекулы воды, что приводит к образованию соединения с двойной углеродной связью. Кротонил-КоА ферментативно восстанавливается в бутирил-КоА. Масляная кислота образуется в реакции переноса кофермента А с молекулы бутирил-КоА на ацетат. Эта реакция более «выгодна» для клетки, так как не приводит к потере энергии (в отличие от реакции простого гидролиза). Образующийся в реакции ацетил - КоА возвращается в метаболический поток и может быть использован для синтеза АТФ или же вновь участвовать в последовательности реакций, ведущих к синтезу масляной кислоты.
Особо важное значение приобретает превращение ацетил - КоА, ведущее к синтезу ацетата, поскольку именно с этим путем связано дополнительное получение клостридиями энергии в процессе маслянокислого брожения. Процесс включает несколько ферментативных реакций. Сначала имеет место окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты, катализируемое пируват ферредоксиноксиредуктазой. Далее с помощью гидрогеназы происходит выделение молекулярного водорода с восстановленного ферредоксина.
Гидрогеназы - одна из групп FeS- содержащих ферментов, катализирующих реакции поглощения и выделения молекулярного водорода, обнаружены у разных групп эубактерий облигатных анаэробов и аэробов, факультативных форм, у хемо - и фототрофных организмов. Различаются строением молекулы, природой доноров и акцепторов электронов, с которыми взаимодействуют, локализацией в клетке, выполняемыми функциями. Но все гидрогеназы катализируют реакцию Н2 → 2Н+ +2е-.
Гидрогеназа C. pasteurianum, один из наиболее детально изученных ферментов, - белок с молекулярной массой примерно 60 000 Да, представленный одной субъединицей. В молекуле содержатся три центра типа Fe4S4. Донором (акцептором) электронов клостридиальной гидрогеназы служит ферредоксин.
При разрушении клеток C. pasteurianum гидрогеназная активность проявляется только в растворимой фракции: в периплазматическом пространстве и цитоплазме. Гидрогеназа, локализованная в периплазматическом пространстве, катализирует необратимую реакцию поглощения Н2. Находящаяся в цитоплазме гидрогеназа способна катализировать реакции как поглощения,так и выделения Н2. У клостридий она входит в состав ферментного комплекса, осуществляющего окислительное декарбоксилирование пирувата.
Основная функция гидрогеназ клостридий (и других облигатных аэробов) заключается в избавлении от избытка образующихся в катаболических реакциях восстановительных эквивалентов (электронов), которые в переносятся на Н+ и удаляются из клетки в виде молекулярного водорода.
Гидрогеназы других эубактерий могут иметь более сложное строение: состоять из нескольких неидентичных субъединиц, содержать помимо FeS –центров флавины и в качестве простетических групп. Помимо ферредоксинов гидрогеназы разных организмов могут взаимодействовать с довольно широким набором переносчиков электронов: цитохромами с, НАД (Ф), хинонами и др.
В то время как поглощение Hа происходит только с участием гидрогеназ, выделение молекулярного водорода у эубактерий, способных к фиксации N2, наряду с гидрогеназой может катализироваться и нитрогеназой. Согласно одной из точек зрения, гидрогеназы возникли в результате усложнения структуры ферредоксинов.
Ацетил-КоА превращается в ацетилфосфат, а затем в ацетат, при этом синтезируется молекула АТФ. Две последние реакции аналогичны тем, которые происходят при образовании уксусной кислоты в пропионовокислом брожении.
Основным источником выделяемых при брожении газообразных продуктов (СО2 и Н2) служит реакция окислительного декарбоксилирования пирувата. У клостридиев описаны и другие пути образования молекулярного водорода. В частности, НАД - Н2, возникающий на гликолитическом пути, может восстанавливать ферредоксин в реакции, катализируемой НАД-Н2:ферредоксиноксидоредуктазой, а с восстановленного ферредоксина Н2 выделяется при участии гидрогеназы. Как видно, природа нашла различные пути для избавления от избытка восстановительных эквивалентов и для регенерирования и последующего возвращения в клеточный метаболизм промежуточных переносчиков водорода.
Выделение уравнения маслянокислого брожения и определение его энергетического выхода затруднительно из-за лабильности процесса, состоящего из двух основных ответвлений одного - окислительного, ведущего к образованию ацетата и АТФ, другого - восстановительного, функция которого - акцептирование водорода, образовавшегося в процессе гликолиза. Количественное соотношение между обоими ответвлениями зависит от многих внешних факторов (состав среды, стадия роста и др.).
Некоторые клостридии (C. acetobutyricum, C. bejerinckii, C. cellobioparum и др.) при сбраживании сахаров наряду с кислотами накапливают в среде нейтральные продукты (бутиловый, изопропиловый, этиловый спирты, ацетон). Особенно много нейтральных продуктов образуется культурой C. acetobutyricum, что дало основание в свое время выделить как вариант маслянокислого брожения ацетонобутиловое брожение. У клостридий, осуществляющих ацетонобутиловое брожение, образование масляной кислоты происходит на первом этапе брожения. По мере подкисления среды (до рН ниже 5) и повышения в ней концентрации жирных кислот индуцируется синтез ферментов, приводящих к накоплению нейтральных продуктов, в первую очередь н- бутанола и ацетона.