При изучении мутации сердцевины пентамера CCGAC двух предполагаемых индуцируемых низко температурой элементов в 5'-области индуцируемого холодом гена BN115 озимого рапса при помощи анализа нерезидентной экспрессии равнодействующих мутированных слияний BN115-промотор-GUS было установлено уменьшение низкотемпературного регулирования промотора. Это указывает на то, что последовательность CCGAC в гене BN115 является чрезвычайно важно для его ответа на низкую температуру. Напротив, мутация двух G-боксов CACGTG, находящихся между индуцируемыми низко температурой элементами в то же области промотора, не изменила индуцируемую холодом экспрессию гена. Замена возможно области энхансера промотора BN115 на энхансер из промотора CaMV 35S выразилась в увеличении уровня низкотемпературно индукции экспрессии GUS.
При изучении кДНК ячменя были получены ген-специфические зонды, кодирующие два типа глицин-богатых белков: HvGRP2, характеризуемы цитокератин-подобно и цистеин-богато областями, и HVGRP3, чья основная особенность - наличие РНК-связывающей области. В ходе исследования было установлено, что экспрессия генов HvGRP2 и HVGRP3, которые присутствуют в одно или двух копиях на кажды гаплоидны геном, была повсеместно, и было показано, что ген HVGRP3 модулируется изменением услови освещения. Холодовое возде ствие также увеличивало уровни содержания мРНК HvGRP2 и HVGRP3.
При изучении действия окружающей среды на экспрессию индуцируемых холодом генов на уровне изменения содержания мРНК и тестировании взаимосвязи экспрессии генов и холодно акклиматизации растений ячменя в фазе третьего и четвертого листа было проведено несколько вариантов опыта. В первом варианте растения были выращены в различных температурных условиях между 20/150C и +4/-40С, во втором варианте растения были перенесены с температуры 20/150C на температуру 6/20C и в третьем варианте опыта растения были выращены в условиях засухи или недостатка питательных веществ. В ходе экспериментов измерялись при помощи метода отрастания морозоустойчивость растений и уровни содержания мРНК для трех индуцируемых холодом генов: blt4.9, blt14 и blt101 из меристематических тканей побегов. Результаты экспериментов показывают, что закаленность растени и уровни экспрессии мРНК генов blt4.9, blt14 и blt101 повышались при более низких температурах роста. В ходе экспериментов было также установлено, что на степень изменения содержания мРНК этих генов в ответ на изменение температуры среды значительное влияние оказывали предшествующие температурные условия и возраст растения. При этом уровень закаленности растений сильно коррелировал с уровнями содержания мРНК этих генов в растениях, выращенных в различных температурных условиях. Эта корреляция не распространялась на растения, подвергнутые действию недостатка питательных веществ или засухи.
При изучении влияния низко температуры на экспрессию генов в Poncirustrifoliataиз закаленных к холоду растений были клонированы шесть кДНК, представляющие уникальные индуцируемые холодом последовательности. В ходе экспериментов было обнаружено, что гены pbcorc115 и pbcorc119 принадлежат к одному семейству генов. Данные сиквенса указывают на то, что pbcorc115 и pbcorc119 содержат открытую рамку считывания, кодирующую полипептид с молекулярно массой 19.8 кДа и полипептид с меньшей молекулярной массой 11.4 кДа, соответственно. Анализ предсказанной аминокислотной последовательности обнаружил три больших повтора в COR19 и только один повтор в COR11. В каждом повторе были выявлены два элемента -Q-кластеризованный тракт и K-богатый мотив. K-богатый мотив был сходен с подобными мотивами у белков класса D-II из хлопка и группы 2 белков LEA. Сериновый кластер, характерный для многих сходных с группой 2 LEA белков, также был найден в этих белках. В то же время было обнаружено, что в них он находился в необычном положении относительно карбокси-конца. В COR19 и COR11 также присутствовал двусторонни мотив основных остатков, сходных с известными ядерными маркерными последовательностями, что позволяет предположить, что члены данного семе ства белков могут иметь ядерную маркерную функцию. В ходе экспериментов авторами была исследована экспрессия мРНК COR19 в ответ на холодовую акклиматизацию, засуху, затопление и засоление. Результаты показали, что экспрессия COR19 в ткани листа индуцировалась в ответ на холодовую акклиматизацию, но подавлялась во время засухи и затопления.
W. Goodwin с соавторами при изучении озимого рапса изолировали кДНК и выделили ген, кодирующий гибридный богаты пролином белок. Предполагаемы белок по структуре является модульным. При анализе его аминокислотной последовательности установлено, что N-терминальная область данного белка имеет свойства сигнального пептида, который может направлять белок в эндоплазматический ретикулум. Последовательность аминокислот от 27 до 287 имеет три области, которые содержат высокие уровни содержания пролина и нескольких других аминокислот, часто встречающихся в богатых пролином белках клеточной стенки. Эти области характеризуются повторяющимся аминокислотным мотивом. С-терминальная область содержит три предполагаемых мембранно-связывающих участка и имеет высокую степень сходства с аминокислотами некоторых разновидностей гибридных богатых пролином белков. На основе этих данных авторы делают вывод, что данный белок секретируется из клетки, размещается в клеточной стенке и заякоривается в плазматической мембране посредством С-терминально области. В ходе экспериментов установлено, что транскрипты, кодирующие данный белок, индуцируются в ткани листа в течение 8 ч обработки холодом и их содержание быстро снижается при возвращении растения к нормальным температурам. В то же время установлено, что транскрипты не индуцируются тепловым шоком, обезвоживанием, экзогенно абсцизовой кислотой или раневым стрессом, тогда как транскрипты контрольного гена B. napusиндуцируются обезвоживанием и экзогенно абсцизовой кислотой.
При изучении экспрессии генов кукурузы были выделены кДНК и соответствующий геномный клон члена семейства генов, кодирующих a-субъединицу фактора элонгации трансляции 1. Предсказанная аминокислотная последовательность из 447 остатков прерывается в гене одним интроном. Саузерн-блот анализ показал, что клонированный ген ef1a - один из семейства, состоящего, по меньше мере, из шести генов. Как показал нозерн-блот анализ, содержание мРНК данного белка в листьях кукурузы увеличивается при низко температуре, в то время как в корнях уровень мРНК ef1 о резко уменьшается. Эти результаты показывают, что экспрессия EF1 о дифференцированно регулируется в листьях и корнях во время холодового стресса.
5. Гены дегидринов и гены индуцируемые экзогенной абсцизовой кислотой
Одними из наиболее изученных семейств генов, индуцируемых низко температурой, являются гены дегидринов и гены, индуцируемые экзогенно абсцизовой кислотой. Гены данных семейств к настоящему времени обнаружены практически во всех изученных видах растений - как травянистых, так и древесных.
При селективном исследовании с использованием первичных антител против богато лизином области дегидринов библиотеки кДНК, созданной из закаленных тканей коры персика, было обнаружено, что некоторые клоны обладают высоко степенью сходства с дегидринами. Нозерн-блоттинг с использованием клона 5А показал, что 1,8 kb участок экспрессировался сезонно и в листопадных, и в вечнозеленых генотипах, а также индуцировался водным дефицитом. Вечнозеленые и листопадные генотипы значительно различались как по их способности к холодовой акклиматизации, так и по сезонно экспрессии транскриптов и белков дегидринов. У обоих генотипов максимум экспрессии транскриптов был отмечен зимо и они не обнаруживались в мае - июле. Экспрессия белков была сходна с экспрессией транскриптов, в то же время экспрессия белка в вечнозеленом генотипе значительно увеличивалась после накопления транскриптов. Полученные данные указывают на то, что во время холодовой акклиматизации могут существовать различные уровни регуляции дегидринов. В ходе исследований авторами также был изолирован клон G10a, содержащий полны ген дегидрина, обозначенный ppdhn1. Этот ген кодировал белок из 472 аминокислот с предсказанным размером 50020 Да. Кодируемы белок содержит девять богатых лизином повторов, характерных для дегидринов и два DEYGNP мотива. Генный блот с использованием зонда к клону 5а показал, что в персике имеется один или два высокогомологичных гена.
При изучении белков, экспрессирующихся в ответ на низкие температуры у Brassicanapus, был очищен до почти гомогенного состояния рекомбинант из белка BN28 и была определена его структура. Антитетела, полученные против rBN28, были использованы для характеристики рекомбинантного и нативного белков. Похожи на многие другие индуцируемые низко температурой белки, BN28 необычайно гидрофилен и термостабилен настолько, что остается в растворе после кипячения. Иммуноблот-анализ клеточных фракци показал, что BN28 не был ассоциирован с клеточными мембранами и находился исключительно в растворимой фракции клетки. Хотя ранее предполагалось, что BN28-подобные белки из Arabidopsisthalianaдолжны обладать антифризной активностью, такая антифризная активность не была определена при рекристализации льда с rBN28.