Выделение мембранных белков (стр. 1 из 4)

Содержание

Введение. 2

1. Структура мембранных белков. 3

2. Выделение мембранных белков. 6

2.1 Солюбилизация мембранных белков. 7

2.1.1 Периферические белки. 7

3. Характеристика очищенных интегральных мембранных белков. 10

3.1 Определение молекулярной массы субъединиц (электрофорез в ПААГ) 10

3.2 Определение молекулярной массы нативного белка с помощью гидродинамических методов. 11

3.3 Метод радиационной инактивации. 12

3.4 Спектральные методы.. 13

3.4.1 Метод кругового дихроизма. 14

3.4.2 Инфракрасная спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния. 15

3.4.3 ЯМР-спектроскопия. 16

3.5 Определение ферментативной активности. 16

3.6 Изучение стехиометрии субъединиц. 17

3.7 Изучение трехмерной структуры с помощью рентгеновской дифракции и реконструкции изображения. 18

3.7.1 Кристаллизация мембранных белков. 18

3.7.2 Реконструкция изображения и двумерные кристаллы.. 20

4. Пример структурных исследований мембранных белков. 21

4.1 Структура поринов. 21

Заключение. 24

Список литературы.. 25

Введение

Цель работы: ознакомление с методами изучения мембранных белков.

Поставленная цель раскрывается через следующие задачи:

исследовать структуру мембранных белков;

рассмотреть методы их выделения и очистки;

методы исследования характеристик мембранных белков.

Известно, что более трети структурной части генома кодирует мембранные белки, однако среди известных пространственных структур лишь менее половины процента принадлежит белкам этого класса.

При этом их роль в организме трудно переоценить. Большое количество функционально значимых белков являются мембранными: рецепторы, каналы, различные ферменты и пр. Кроме того, многие из них являются мишенями для лекарственных препаратов: более 70% существующих лекарственных средств действуют именно на мембранные белки. Таким образом, изучение механизмов функционирования мембранных белков необходимо, а одним из первых шагов к пониманию механизма является получение пространственной структуры.

1. Структура мембранных белков

Основная роль липидов в составе мембран заключается в стабилизации бислойной структуры, а белки являются активными компонентами биомембран.

Используя мембрану эритроцитов как модель, исследователи выявили два типа мембранных белков. Белки первого типа, называемые периферическими белками, связаны с мембраной в основном ионными взаимодействиями. Если обработать препарат мембран буферным раствором с высокой концентрацией солей, белки этого типа освобождаются от мембраны и переходят в буфер. Примеры периферических белков – фибронектин(локализован на наружной поверхности большинства клеток, исключая циркулирующие клетки крови) и спектрин (находится на внутренней поверхности большинства клеточных мембран, особенно в эритроцитах).

Мембранные белки второго типа называются интегральными белками. Эти протеины или погружены в толщу липидного бислоя, или пронизывают мембрану насквозь (трансмембранные белки). К интегральным относят также белки, ковалентно связанные с молекулами мембраны. Все интегральные белки можно выделить. только разрушив мембрану. Для выделения и изучения интегральных белков их очищают от липидов, либо экстрагируя их органическими растворителями (такими как ацетон или спирты), либо растворяют липиды с помощью детергентов. Большинство мембранных белков являются интегральными.

На заре развития мембранологии полагали, что мембранные белки по своей структуре довольно гомогенны и уложены в виде β-слоев по поверхности бислоя. Сейчас принято считать, что большинство мембранных белков в своей мембранной части состоят из одной или нескольких ассоциированных α-спиралей, многие мембранные белки олигомеризуются. Причем “правильная” олигомеризация α-спиралей является необходимым условием выполнения белком своей функции. Наиболее изученным из олигомеризующихся мембранных белков является белок эритроцитов человека - гликофорин А, который образует устойчивый димер не только в природных системах, но и в искусственных липидных средах, таких как мицеллы додецилфосфохолина (DPC). Интегральные мембранные белки могут оказаться гораздо сложнее, чем мы сейчас представляем. Классификация растворимых белков по типам структур была проведена только после того, как установили с высоким разрешением структуру более 100 различных белков. Что касается трансмембранных белков, то это удалось сделать только в одном случае - для белка фотосинтетического реакционного центра бактерий. Вместе с электронно-микроскопическими данными низкого разрешения о структуре бактериородопсина это единственный источник, на котором может основываться построение моделей для большинства других трансмембранных белков. Молекулярная масса мембранных белков обычно варьирует в пределах от 10 тыс. до 240 тыс.

Еще один важный момент - способы прикрепления белков к мембране:

1. Связывание с белками, погруженными в бислой. В качестве примеров можно привести F1-часть Н + - АТРазы, которая связывается с Fo-частью, погруженной в мембрану; можно упомянуть также некоторые белки цитоскелета.

2. Связывание с поверхностью бислоя. Это взаимодействие имеет в первую очередь электростатическую природу (например, основный белок миелина) или гидрофобную (например, поверхностно-активные пептиды и, возможно, фосфолипазы). На поверхности некоторых мембранных белков имеются гидрофобные домены, образующиеся благодаря особенностям вторичной или третичной структуры. Указанные поверхностные взаимодействия могут использоваться как дополнение к другим взаимодействиям, например к трансмембранному заякориванию.

3. Связывание с помощью гидрофобного "якоря"; эта структура обычно выявляется как последовательность неполярных аминокислотных остатков (например, у цитохрома 65). Некоторые мембранные белки используют в качестве якоря ковалентно связанные с ними жирные кислоты или фосфолипиды.

4. Трансмембранные белки. Одни из них пересекают мембрану только один раз (например, гликофорин), другие - несколько раз (например, лактозопермеаза; бактериородопсин).

Различиями между наружными (или периферическими) и внутренними (или интегральными) мембранными белками не задается однозначно способ их прикрепления к бислою; эти различия определяют лишь относительную силу их связывания.


Рис. 1

Различные способы прикрепления мембранных белков к мембране. Пептидный якорь (4) может находиться либо на N-, либо на С-конце молекулы. N– и С-концы трансмембранных белков (5 и 6) могут находиться как у наружной, так и у внутренней поверхности мембраны.

2. Выделение мембранных белков

Очистка и характеристика мембранных белков ставят перед исследователем целый ряд специфических проблем, с которыми он обычно не сталкивается, работая с растворимыми белками. Мембранные белки, как правило, прочно связаны с липидным бислоем и фактически нерастворимы в воде. Поэтому для их солюбилизации и очистки приходится применять детергенты или другие разрушающие мембрану вещества. Поскольку выделение интегральных белков обычно сопряжено с разрушением мембраны, во многих случаях необходимо убедиться, что в процессе выделения и очистки белка его функциональная активность не оказалась нарушенной или утраченной. Для этого, в частности, можно попытаться провести реконструкцию,

т.е. встроить очищенный белок обратно в мембрану. Функциональную активность некоторых мембранных белков, таких, как ионные каналы или транспортные белки, можно охарактеризовать и измерить только в реконструированных мембранных системах. Для других мембранных белков, выполняющих функции ферментов или рецепторов, полезную информацию часто можно получить, используя солюбилизированные препараты. Методы солюбилизации и реконструкции не только дают ценную информацию о функциях мембранных белков; их можно также использовать для того, чтобы перевести эти белки в состояние, удобное для проведения детального структурного анализа. Несомненно, детергенты будут играть ключевую роль в совершенствовании методов кристаллизации мембранных белков для последующего рентгеноструктурного анализа.

При солюбилизации детергентами возникает вопрос о возможности избирательного извлечения из мембраны именно тех компонентов, которые интересуют исследователя. Поэтому любой новый детергент желательно проверять на возможность избирательной экстракции определенных мембранных компонентов. Ни один из имеющихся детергентов не является универсальным.

Это обусловлено тремя обстоятельствами:

1) сильными различиями в действии детергентов даже на одни и те же мембранные белки;

2) отсутствием единой стратегии солюбилизации и реконструкции;

3) сложным характером взаимодействий между молекулами белков, липидов и детергентов, имеющих столь разную химическую природу.

Существуют определенные требования к детергентам, применяемым для солюбилизации и реконструкции. Детергент должен солюбилизировать, но не денатурировать белок и должен быть легко доступен в чистом виде; желательно, чтобы детергент был недорогим.

2.1 Солюбилизация мембранных белков

2.1.1 Периферические белки

В зависимости от задачи, которая стоит перед исследователем, мембрана может быть подвергнута мягкой или жесткой обработке.

При мягких условиях обработки используют как растворы с низкой ионной силой (например, 0,1-1 мМ ЭДТА, который удаляет двухвалентные катионы), так и буферы с высокой ионной силой, содержащие NaCl и КСl в концентрации более 1 М, с добавлением ЭДТА или без нее. Не следует вводить в эти растворы такие анионы, как йодид или дииодсалицилат, поскольку они обладают хаотропнымн свойствами и могут действовать подобно детергентам. рН среды может меняться в пределах от 6,0 до 8,0. В этих условиях необратимая денатурация интегральных или периферических белков маловероятна.