На основе исследования свойств микроорганизмов определили их видовую принадлежность /53/. Бактерии рода Listeria представляют собой короткие палочки правильной формы с закругленными краями. Грамположительные, неспорообразующие, каталазоположительные. Следовательно, культуры 3, 7, G, I’ можно отнести к данному роду, т. к. они имели форму коротких палочек, окрасились в фиолетовый цвет (грамположительные) и не образовывали при определении каталазы «пенистую шапку». Данные микроорганизмы широко распространены в окружающей среде, некоторые виды патогенны для человека и животных.
Культуру F можно отнести к роду Brochotrix. Данные микроорганизмы имеют палочки правильной формы в цепочках, грамположительные и каталазоположительные. Эти признаки наблюдались при изучении свойств культуры F. Данные организмы широко распространены в природе.
Бактерии рода Bacillus имеют форму прямых палочек с закругленными концами, грамположительные, подвижные и образующие овальные эндоспоры, каталазоположительные. Как видно из данных табл. 4, все эти признаки относятся к культуре I. Данные микроорганизмы обнаруживаются в разнообразных местообитаниях, некоторые виды патогенны для позвоночных и беспозвоночных.
Липолитические свойства микроорганизмов определяли посевом в бульон Штерна, где в качестве единственного источника углерода использовали оливковое масло с концентрацией 1 см3/100 см3 бульона. Бактерии, обладающие липолитическими свойствами, при ферментации оливкового масла извлекают из него альдегиды, подкисляя среду, при этом окраска бульона переходит из золотисто-желтой в розовую. Стерильный бульон Штерна разливали в пробирки по 10 см3 в каждую и вносили исследуемые культуры. Пробирки с микроорганизмами термостатировали при температуре (38±0,5)0С. В течение 120 ч проводили визуальные наблюдения за изменением физических свойств бульона Штерна, которые выражались в образовании хлопьев, а также в изменении цвета и прозрачности. В качестве контрольного варианта использовали состав, включающий в себя бульон Штерна без введения микроорганизмов. Результаты наблюдений представлены в табл. 5.
Таблица 5. Влияние типов бактерий на свойства бульона Штерна
| Тип колоний | Показатели качественного состояния бульона | Характеристика изменения качественного состояния бульона через | |||||
| (род) | Штерна | 0 ч | 24 ч | 48 ч | 72 ч | 96 ч | 120 ч |
| Контрольный вариант | Цвет бульона | золот-желт | золот-желт | золот-желт | золот-желт | золот-желт | золот-желт |
| Наличие хлопков | - | - | - | - | - | - | |
| Ширина жирового кольца, мм | 2,0 | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 | |
| Наличие помутнения | - | - | - | - | - | - | |
| рН | 6,5 | 6,5 | 6,5 | 6,5 | 6,5 | 6,5 | |
| Listeria | Цвет бульона | золот-желт | золот-желт | золот-желт | золот-желт | с роз. оттенком | розовый |
| sp I' | Наличие хлопков | - | - | - | - | - | - |
| Ширина жирового кольца, мм | 2,0 | 2,0 | 2,0 | 2,0 | 2,0 част разрушение кольца | 2,0 част разруш-ие кольца | |
| Наличие помутнения | - | +/- | +/- | +/- | +/- | +/- | |
| рН | 6,5 | 6,5 | 6,0 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | |
| Listeria | Цвет бульона | золот-желт | золот-желт | золот-желт | золот-желт | золот-желт | золот-желт |
| sp 3 | Наличие хлопков | - | - | - | - | - | - |
| Ширина жирового кольца, мм | 2,0 | 2,0 | 2,0 | 2,0 | 2,0 | 2,0 | |
| Наличие помутнения | - | + | + | + | + | + | |
| рН | 6,5 | 6,5 | 7,0 | 7,0 | 7,5 | 7,5 | |
Как видно из данных, представленных в табл. 5, практически для всех типов микроорганизмов в процессе культивирования не наблюдалось образование хлопьевидного осадка, за исключением культур 7, G. Для них характерно появление хлопков вследствие продуцирования экзоферментов в последние 72–120 ч. Использование оливкового масла бактериями в качестве источника энергии и углерода подтверждалось переходом окраски из золотисто-желтой в розовую, за счет образования в результате деструкции жировых веществ, альдегидов и жирных кислот, что вело к понижению величины рН. Данная зависимость наблюдалась для культур I¢, 7, G через 72–96 ч культивирования. Изменение прозрачности бульона, в основном, через 48 ч у всех культур, кроме контрольного варианта, свидетельствовало об интенсивном росте и развитии микроорганизмов.
Таким образом, в результате проведения данной части дипломной работы были исследованы морфолого-физиологические и культуральные свойства микроорганизмов и определена их видовая принадлежность. Так культуры 3,7, I¢ относятся к роду Listeria, F- к роду Brochotrix, I – к Bacillus.
3.2 Влияние условий культивирования на свойства ферментного препарат а, продуцируемого культурой рода Listeria
Целью второго этапа эксперимента являлось определение оптимального времени культивирования для получения ферментного препарата с заданными свойствами.
На основании первой серии эксперимента для дальнейшего исследования были выбраны три культуры рода Listeria типа 3, 7, I', а также среды, содержащие следующие виды СПАВ: Превоцелл W-OF-7, Wetter HAC, Гамма и De-sol-A. Для получения биомассы исследуемых культур микроорганизмов, активизированных в первой части, готовили бактериальные суспензии. Для этого каждую выросшую культуру не скошенном агаре переносили в колбы Эрленмейера на 250 см3, содержащие по 200 см3 жидкой синтетической среды, приготовленной в соответствии с п. 2.2.1. Культивирование проводили при (38±0,5)0С при переменном механическом воздействии, осуществляемом на «Shaker Type» с частотой колебания 250 об/мин, с амплитудой 6 по 2 часа в сутки.
Через каждые 24 часа культивирования снимали следующие характеристики: подсчет величины КОЕ (п. 2.2.2), определение рН (п. 2.2.13), кислотности, мутности (п. 2.2.7), а также концентрации анионактивных и неионогенных СПАВ согласно п. 2.2.12.1 и п. 2.2.12.2. Для определения концентрации белка по Ярош, липолитической и протеолитической активностей брали сырую поверхностную культуру, которую получали путем высаливания NH4(SO4)2 из пробы с расходом 30% от объема, согласно п. 2.2.8. Затем отделяли фугат от осадка. Оставшуюся часть (50 мл) выпаривали в фарфоровой чашке и готовили пробу для качественного анализа вещества по ИК-спектрам поглощения в соответствии с п. 2.2.14. Осадок растворяли в 25 мл дистиллированной воды и проводили определение протеолитической, липолитической активностей и концентрации белка. Данные результатов исследования для культур рода Listeria sp 3 приведены в табл. 6, типа 7 – в табл. 7, типа I' – в табл. 8.
Степень вовлечения в конструктивный и энергетический обмен оценивали по изменениям интенсивности по ИК-спектров и концентрации СПАВ.
Как видно из данных, представленных в табл. 6–8 и на рис. величина КОЕ (колонии образующие единицы) для сред с Превоцелл W-OF (культура рода Listeria sp 3, I'), Wetter HAC (3,7, I') начинала увеличиваться с начала культивирования, достигая максимума к 48 ч. Так для среды, содержащей Превоцелл W-OF-7 и культуру Listeria sp 3 lg КОЕ=3,05 и увеличивается до lg КОЕ=4,60. Затем данная величина начинала уменьшаться до lg КОЕ=3,70. Вероятно это можно объяснить тем, что в начале культивирования (0 ч) наблюдалось увеличение числа клеток в результате возрастания частоты клеточного деления, что соответствовало лаг-фазе. Вторая логарифмическая фаза характеризуется постоянной продолжительностью существования возникающих друг за другом клеток. Затем наблюдался переход в стационарную фазу размножения (достижение максимума lg КОЕ). После наступала фаза отмирания, когда биомасса клеток уменьшается за счет автолитических процессов и лимитирования по субстрату для Превоцелл W-OF-7 (культура Listeria sp 3) до lg КОЕ=3,70. Увеличение величины КОЕ также подтверждается возрастанием мутности. Для Превоцелл W-OF-7 (культура типа 3) и Wetter HAC (культура типа 7) мутность повышается с 0,04 до 0,17 и с 0,035 до 0,22 соответственно. Lg КОЕ увеличивается до определенного момента, а затем уменьшается, а мутность постоянно возрастает. Это можно объяснить увеличением концентрации белка с 0 до 1,55 г./дм3 – для среды, содержащей Превоцелл W-OF-7 (культура типа 3) и с 0 до 1,05 г./дм3 – для cреды, содержащей Wetter HAC (культура типа 7).
Для таких СПАВ, как Гамма, De-sol-A и Превоцелл W-OF-7 (культура Listeria sp 7) роста колоний не наблюдалось, но о развитии прокариотических организмов свидетельствует увеличение показателя мутности и концентрации белка. Также был вычислен индекс скорости размножения – µ и время регенерации-g.
Индекс скорости размножения рассчитывали по формуле (12):
Ln (N/N0)
µ= –––––––––––––––––––, (12)
t
где µ-индекс скорости размножения;
N0 - число клеток в нулевой точке отсчета времени;
N-число клеток в любое, более позднее время;
t – время, ч.
Время регенерации определяли по формуле (13):
log N-log N0
g= ––––––––––––––––––, (13)
log 2
где g-время регенерации;
N-число клеток в нулевой точке отсчета времени;
N0 – число клеток в любое, более позднее время.