Объектами исследования были изоляты гриба A. alternata f. sp. lycopersici, выделенные из пораженных плодов и листьев томатов. Также объектами исследования были проростки растений томатов.
2.1 Выделение гриба в чистую культуру и подготовка растений к инокуляции
Из пораженных образцов томатов были выделены чистые культуры гриба. Выделение чистой культуры проводилось с использованием стандартных микробиологических методов. Посев осуществлялся в чашках Петри на агаризованную питательную среду – картофельно-глюкозный агар. Также в колбы по 100 мл на жидкую питательную среду Чапека. Семена растений томатов Лагідний и КВС, помещали в стаканчики с универсальной почвой. Дальнейшее исследования проводились с 50 дневными растениями. Опыт осуществлялся в 3-х повторностях.
2.2 Инокуляция растений
А) Инокуляция стеблей
Растения инокулировали в возрасте 8 недель. Для инокуляции растений основной стебель горизонтально срезали стерильным лезвием. Одну высечку мицелия, диаметром 5 мм, аккуратно помещали мицелием вниз на срезанный стебель. Инокулированные растения инкубировали во влажной камере в течение 48 часов. Через два дня зараженные растения помещались в комнату с меньшей влажностью. Длину поражений (в мм) на каждом растении измеряли на 4 и 7 сутки после инокуляции.
Б) Инокуляция листьев
Листья 60 дневных растений томатов, помещались на фильтровальную бумагу в чашки Петри, предварительно смоченную дистиллированной водой, для достижения необходимой влажности. На листья аккуратно помещали капли с суспензией спор (концентрация ……). Инокулированные листья оставляли в чашках Петри на протяжении 48 часов, после чего отмечали появление хлоротических пятен вокруг капель.
В) Оценка поражений на токсичность
Проводились срезы 8 недельных растений томатов под струей воды, затем эти срезы помещались в колбы на 100мл с культуральными фильтратами
A. alternata f. sp. lycopersicy. Растения оставляли в колбах на протяжении 24 часов. После чего наблюдали степень увядания растений томатов.
2.3 Статистическая обработка данных
Статистическая обработка данных проводилась с использованием дисперсионного анализа (р < 0,05). Вычисления проводились при помощи программы Statistica 6.0.
3. Результаты собственных исследований
В ходе проведения исследования нами было выделено в чистую культуру 3 изолята A. alternata f. sp. lycopersicy. Выделение изолятов проводилось из растений томатов.
3.1 Оценка устойчивости растений и вирулентности изолятов гриба при инокуляции листьев
В ходе наших исследований были испытаны различные методы заражения растений и проведена оценка их устойчивости к этому патогену.
При инокуляции стеблей томатов наблюдалось образование некротической зоны от светло-коричневого до черного цвета. (фото С1, С2, С3; КВС1, КВС2, КВС3)
По результатам дисперсионного анализа при инокуляции стеблей двух сортов томатов было установлено, что существует четкая разница между 3-мя изолятами гриба
A. alternata f. sp. lycopersici, между сортами, а также между сутками инокуляции (Табл. 1).
Изолят I более вирулентен, по отношению к изоляту II и III. При заражении стеблей томатов сорта КВС изолятом I некротическая зона на 4 сутки составила 5 мм, а на 7 сутки – 6,25 мм. При заражении сорта КВС изолятом II некротическая зона на 4 сутки составила – 3,5 мм, на 7 сутки – 5,25 мм. При заражении сорта КВС изолятом III некротическая зона на 4 сутки составила 3,5 мм, а на 7 сутки – 4 мм (Рис. 7.).
При заражении стеблей томатов сорта С изолятом I некротическая зона на 4 сутки составила – 5,75 мм, на 7 сутки – 6,5 мм. При заражении стеблей изолятом II, некротическая зона на 4 сутки составила – 5 мм, на 7 сутки – 6,25 мм. При заражении стеблей изолятом III, некротическая зона на 4 сутки составила – 4 мм, на 7 сутки – 5 мм (Рис. 8.).
Сорт С является более восприимчивым, по отношению к сорту КВС (Рис. 9.). Так, средний размер некроза при заражении 3-мя изолятами у сорта С на 4 сутки составил – 4,91 мм, а у сорта КВС – 4 мм. На 7 сутки средний размер некроза при заражении 3-мя изолятами у сорта С составил – 5,91 мм, у сорта КВС – 5,16 мм .
Таблица 1.
Результаты дисперсионного анализа при заражении стеблей томатов
| Эффект | SS | Степени свободы | MS | F | p |
| Сорт | 8,333 | 1 | 8,333 | 5,5556 | 0,023980 |
| Изолят | 24,500 | 2 | 12,250 | 8,1667 | 0,001190 |
| Сутки | 14,083 | 1 | 14,083 | 9,3889 | 0,004120 |
| Ошибка | 54,000 | 36 | 1,500 |
3.2 Оценка устойчивости растений и вирулентности изолятов гриба при инокуляции листьев каплями с суспензией спор
При инокуляции листьев томата сортов КВС и С наблюдалось образование хлоротических пятен на месте нанесения капель. При визуальной оценке мы выявили, что хлороз практически не образовался на листьях сорта КВС, более хорошо выражен на листьях сорта С.
Наибольшая площадь хлротических пятен наблюдалась под действием изолята I (фото)
3.3 Оценка устойчивости растений и вирулентности изолятов гриба при оценке повреждений на токсичность
Таблица 2.
Степень увядания растений томатов сортов КВС и С
| Сорт | КВС | С |
| Изолят I | 0 | 4 |
| Изолят II | 0 | 4 |
| Изолят III | 4 | 4 |
| Контроль | 0 | 0 |
Выводы
1. При проведении исследований в чистую культуру были выделены три изолята гриба A. alternata f. sp. lycopersici из пораженных растений томатов.
2. В результате отработки методов заражения на стеблях томатов была установлена четкая разница между изолятами гриба а также сортами. Более вирулентным оказался изолят I, более восприимчивый сорт – С.
3. При инокулировании листьев томатов наблюдалось появление хлоротических пятен. Больше хлоротических областей было на сорте С. Более вирулентным является изолят I.
4. При проверке действия токсинов на растения томатов установлена четкая разница между сортами. Более восприимчив сорт С.
1. Акулов А. Ю. Индуцированная неспецифическая устойчивость растений: история и современность / А. Акулов, Д. Леонтьев. – Х.: Харьковский Национальный университет им. В.Н.Каразина, - 37 с.
2. Демидов Е. С. Методы селекции томата на устойчивость к альтернариозу / Демидов Е. С., Садыкина Е. И., Сайчук А. И. – Приднестровский научно-исследовательский институт сельского хозяйства. – 2006 . – 100 с.
3. Chaerani R. Tomato early blight (Alternaria solani ): the pathogen, genetics, and breeding for resistance / Reni Chaerani, Roeland E. Voorrips // J Jen Plant Pathol. – 2006, 72:335–347
4. Clouse D. Interaction of the asc Locus in F8 Paired Lines of Tomato with A lternaria alternata f. sp. lycopersici and AAL-Toxin / D. Clouse, D.G. Gilchrist // Phytopathology. – 1987. – p. 80-82.
5. Custers J. H.H.V. Engineering disease resistance in plants: дис. Custers Jerфme H.H.V. – W., 2007. – 182 s.
6. Durrant W.E Systemic acquired resistance / W.E. Durrant, X. Dong // Phytopathology. – 2004. – N. 42. – p. 185 – 209.
7. Franklin L. Alternaria Deseases / Laemmlen Franklin // Agriculture and Natural Resources. – 2001.
8. Fritz M. Resistance induction in the pathosystem tomato – Alternaria solani: dissertation: 30.09.05 / Maendy Fritz. – G., 2005. – 124 s.
9. Fungal Databases Nomenclature and Species Banks [Electronic resource]
10. Magan N. Effect of Water Activity and Temperature on Mycotoxin Production by Alternaria alternata in Culture and on Wheat Grain / Naresh Magan, George R. Cayley, John Lacey // Applied and environmental microbiology. – 1984. - Vol. 47, No. 5. - p. 1113-1117.
11. Mesbah. L. A. Sensitivity among species of Solanaceae to AAL toxins produced by Alternaria alternata f.sp. lycopersici / L. A. Mesbah, G. M. van der Weerden, H. J. J. Nijkamp, J. Hille // Plant Pathology. – 2000. - Vol. 49. – p. 734-741.
12. Morisseau C. Multiple Epoxide Hydrolases in Alternaria alternata f. sp. Lycopersici and Their Relationship to Medium Composition andHost-Specific Toxin Production / Christophe Morisseau, Barney L. Ward, David G. Gilchrist, Bruce D. Hammock // Applied and environmental microbiology. – 1999. - Vol. 65, No. 6. - p. 2388–2395.
13. Motta S. A method for the determination of two alternaria toxins, alternariol and alternariol monomethyl ether, in tomato products / Silvana da Motta, Lucia M. Valente Soares // Brazilian Journal of Microbiology. – 2000. – Vol. 31. – p. 315-320.
14. Nishimura S. Host-specific toxins and chemical structures from Alternaria species / Syoyo Nishimura, Keisuke Kohmoto // Ann. Rev. Phytopal. – 1983. – p.87-116
15. Norman C., Howell K. A. et al. Salicylic Acid Is an Uncoupler and Inhibitor of Mitochondrial Electron Transport // Plant Physiol. Australia, 2004, Vol. 134, pp. 492–501.
16. Pound G. S. The production of toxic material by alternaria solani and its relation to the early blight disease of tomato / Glenn S. Pound, Mark A. Stahmann // Phytopathology. – 1951. – Vol.41. – p. 1104-1114.
17. Seo H.S., Song J.T. et al. Jasmonic acid carboxyl metiltransferase: A key enzyme for jasmonate-regulated plant responses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2001, Vol. 98. No 8. – p. 4788-4793.
18. Thoma B. P. H. J. Alternaria spp.: from general saprophyte to specific parasite // Bart P. H. J. Thoma // Molecular Plant Pathology. – 2003. – Vol. 4. No. 4. – p. 225–236.
19. Vйlez H. Alternaria alternata mannitol metabolism in plant-pathogen interactions: dissertation / Heriberto Vйlez. – R., 2005. – 130 p.
20. Wang H. Apoptosis: A functional paradigm for programmed plant cell death induced by a host-selective phytotoxin and invoked during development / Hong Wang, Juan Li, Richard M. Bostock, David G. Gilchrist // The plant cell. – 1996. – Vol. 8. – p. 375-391.
21. Wang H. Fumonisins and Alternaria alternata lycopersici toxins: Sphinganine analog mycotoxins induce apoptosis in monkey kidney cells / Hong Wang, Clinton Jones, Janice Ciacci-Zanella, Todd Holt, David G. Gilchrist, Martin B. Dickman // Proc. Natl. Acad. Sci. – 1996. – Vol.93. No 8. – p. 3461-3465.
22. Witsenboer H. M.A. Effects of Alternaria Alternata f.sp. Lycopersici toxins at different levels of tomato plant cell development / Hanneke M.A. Witsenboer, Carla E. van Schaik, Raoul J. Bino, Huub J.M. Loffler, H. John J. Nijkamp, Jacques Hille // Plant Science. – 1988. – Vol. 56. – p. 253-260.