Детальные исследования природных РНК-ферментов послужили мощным стимулом к моделированию и синтезу рибозимов заданного строения. Эти работы позволили установить, что каталитической активностью обладают не только крупные РНК (~ 400 нуклеотидов у тетрахимены), но и короткие 13 — 20-членные олигонуклеотиды, которые могут быть синтезированы invitro. Такие рибозимы стали называть минизимами.
I.6.2 Возникновение древнего мира РНК
Именно открытие каталитически активных РНК – рибозимов привело к созданию концепции «мира РНК». Вскоре после открытия рибозимов Т. Чеком в одной из своих работ Ф. Крик писал: «Эти эксперименты (по каталитической РНК) поддерживают гипотезу, что биохимия РНК предшествовала традиционной биохимии, основанной на нуклеиновых кислотах и белках».
А Белозерский в 1957 году писал: «Нет никаких сомнений, что в процессе развития органического мира нуклеиновые кислоты играли значительную роль. Однако вряд ли на ранних этапах развития жизни возникли одновременно и РНК, и ДНК. Нам представляется, что возникновение рибонуклеотидов и затем РНК было первичным. ДНК возникла значительно позже и параллельно с усложнением функций и все большей дифференциацией протоплазмы».
Теперь можно было предположить, что молекулы РНК могли бы обходиться не только без ДНК как генетического вещества, но и без белков для осуществления катализа важных синтетических и метаболических реакций. Идея древнего безбелкового мира РНК как возможного предшественника современной жизни на Земле была окончательно сформулирована в 1986 г. и быстро приобрела многочисленных сторонников. В настоящее время гипотеза о том, что жизнь начиналась с молекул РНК и их ансамблей, является общепринятой. Таким образом, термин «мир РНК» широко используется теперь для обозначения древней, пребиотической ситуации на Земле, имевшей место около 4 млрд. лет назад, когда самореплицирующиеся молекулы РНК или их ансамбли могли существовать и эволюционировать без белков.
Таким образом, согласно существующим представлениям, в древнем мире РНК не было ни белков, ни ДНК, а лишь ансамбли различных молекул РНК, выполняющих разные вышеперечисленные функции. Однако вопрос о возникновении такого мира на Земле – один из самых трудных в науке о происхождении жизни. Можно предполагать, что первичные олигорибонуклеотиды возникали из абиогенно (вне организма без участия ферментов) образующихся монорибонуклеотидов или их активированных производных путем полимеризации на поверхностях глин и глиноподобных минералов. Возможно также, что был этап, предшествующий химической эволюции нуклеотидоподобных и олигонуклеотидоподобных соединений. В любом случае, появление олигорибонуклеотидов должно было быть отправной точкой появления мира РНК. Однако для дальнейшего развития было необходимо, чтобы абиогенный синтез олигорибонуклеотидов, основанный на редких случайных событиях, был дополнен постоянным механизмом, который мог бы генерировать варианты этих олигомеров и удлинять их (при сильной тенденции к их спонтанной химической и физической деструкции). Элонгация коротких олигорибонуклеотидов в полирибонуклеотиды представляется абсолютно необходимым условием для образования компактно свернутых структур со свойствами специфического узнавания лигандов и каталитическими активностями, а генерация вариантов в популяции абиогенных олиго- и полирибонуклеотидов требуется для того, чтобы дать возможности для случайного возникновения нужных функциональных, в том числе каталитических, активностей.
В течение долгого времени не было предложено сколько-нибудь удовлетворительного решения этой проблемы. Около 10 лет назад А.Б. Четвериным и сотрудниками был разработан метод молекулярного клонирования РНК: из единичных молекул РНК, помещенных на поверхность геля, содержащего катализатор репликации (в данном случае вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу) и рибонуклеозидтрифосфаты, оказалось возможным выращивать колонии молекул РНК, идентичных исходной молекуле. Позднее метод был применен для регистрации единичных событий, происходящих внутри популяции РНК в растворе, и была впервые экспериментально показана способность молекул РНК к спонтанной перестройке их нуклеотидных последовательностей в отсутствие каких-либо ферментов и рибозимов. Открытая спонтанная реакция характеризовалась следующими особенностями. Во-первых, цепи РНК в растворе при температурах от 5 до 37°С время от времени обмениваются частями своих последовательностей; обмен может происходить как между разными молекулами (транс-перестройки), так и внутри одной и той же молекулы (цис-перестройки). Во-вторых, эти перестройки не специфичны по отношению к последовательности и могут происходить в любом месте цепей. В-третьих, в отличие от рибозимных и ферментативных реакций, а также реакций самокатализируемого сплайсинга, З'-гидроксилы не участвуют в этой спонтанной реакции, а молекулы или участки РНК реагируют друг с другом внутренними районами. Реакция зависит от присутствия Мg2+. Скорость спонтанных перестроек невелика – одно событие в час на миллиард нуклеотидов; это означает, что 0.002-0.02% цепей РНК с длиной 800-8000 нуклеотидных остатков спонтанно перестраиваются в популяции РНК в течение 24 ч. Реакция не требует никаких других компонентов, кроме самой РНК и Мg2+, и, таким образом, может рассматриваться как присущее РНК химическое свойство и должна происходить повсюду в живой и неживой природе.
Появление достаточно длинных полирибонуклеотидов и генерация вариантов за счет спонтанных цис- и транс-перестроек должны были привести к случайному появлению рибозимов, и критическим этапом должно было стать возникновение в популяции РНК рибозима, катализирующего процесс комплементарной репликации РНК. Это – принципиальное условие для того, чтобы размножить – амплифицировать – единичные молекулы случайно возникших в популяции вариантов и сохранить их для эволюции. Другими словами, появление механизмов РНК-катализируемой репликации РНК должно рассматриваться как первое и необходимое условие для начала эволюции мира РНК. С появлением таких рибозимов – хотя бы одной молекулы на популяцию молекул РНК в каком-то небольшом водоеме – мир РНК обрел свою сущность как самосохраняющаяся и развивающаяся материя на древней Земле.
Возникновение и существование мира РНК на Земле, естественно, могло иметь место только в жидкой водной среде с нейтральным рН и растворенными солями одновалентных металлов (в первую очередь К+ и Na+) и Мg²+. Скорее всего это были мелкие водоемы и лужи («Дарвиновские пруды»), где могли концентрироваться абиогенно возникающие органические вещества; океанские просторы вовсе не годились для этого. (Впрочем, как полагает большинство геологов и палеонтологов, в то время океаны на Земле, по-видимому, еще и не существовали.) Присутствие РНК-репликазной активности в водной среде РНК-содержащей лужи или пруда давало в результате эффект амплификации всех олиго- и полирибонуклсотидов этого водоема, т.е. рост общей популяции молекул РНК. Однако на этом этапе еще не могло быть никакого отбора «лучших» и, стало быть, никакой биологической эволюции.
Дело в том, что в таком случае эффективный РНК-реплицирующий рибозим, присутствующий в луже, одинаково хорошо должен был амплифицировать как редкие молекулы РНК, обладающие какими-либо полезными для популяции свойствами (например, свойством адсорбировать из среды различные субстраты или катализировать синтез нужных веществ), так и основную массу неактивных, балластных молекул РНК. Чтобы естественный отбор начал работать, необходима была какая-то форма компартментализации, обособления отдельных ансамблей РНК, в которых рибозимы и их продукты удерживались бы вместе. Только тогда естественный отбор мог отличить те РНК, чей продукт лучше, и те ансамбли, чьи РНК функционально лучше дополняют друг друга. Лучшие обособленные ансамбли РНК – первозданные особи – должны расти быстрее других, перерастать других, тем самым обеспечивая отбор лучших.
А.Б. Четвериным и сотрудниками экспериментально показана способность молекул РНК формировать молекулярные колонии на гелях или других влажных твердых средах, если на этих средах им предоставлены условия для репликации. Смешанные колонии РНК на твердых или полутвердых поверхностях и могли быть первыми эволюционирующими бесклеточными ансамблями, где одни молекулы выполняли генетические функции (репликацию молекул РНК всего ансамбля), а другие формировали структуры, необходимые для успешного существования (например, такие, которые адсорбировали нужные вещества из окружающей среды) или были рибозимами, ответственными за синтез и подготовку субстратов для синтеза РНК. Такая бесклеточная ситуация создавала условия для очень быстрой эволюции: колонии РНК не были отгорожены от внешней среды и могли легко обмениваться своими молекулами – своим генетическим материалом.
Эта альтернатива представляется наиболее вероятной потому, что образование колоний РНК легко себе представить в случае естественного подсыхания лужи, населенной молекулами РНК: на влажной поверхности глины, в тех местах, где оказывался РНК-реплицирующий рибозим, молекулы РНК, осевшие на поверхность, должны были амплифицироваться и образовывать коло_А_ – при условии, что необходимые органические вещества (предшественники пуринов, пиримидинов, рибозы, и т.д.) и высокоэнергетические фосфаты присутствовали на той же поверхности. Таким путем могли образовываться смешанные колонии РНК с различными функциональными активностями. Такой ансамбль молекул РНК в виде смешанной колонии мог успешно существовать и расти, если он включал в себя лиганд-связывающие РНК для избирательной адсорбции и аккумуляции необходимых веществ из окружающей среды, набор рибозимов, катализирующих метаболические реакции для синтеза нуклеотидов и их активированных (фосфорилированных) производных, и рибозим, катализирующий комплементарную репликацию всех РНК колонии.