Антиоксидантные свойства дигидрокверцетина (стр. 6 из 8)
Скорость взаимодействия с АФК лимитируется только диффузионной составляющей. Для гидрофильных антиоксидантов (гипоксен и аскорбиновая кислота) такого эффекта не наблюдается, и сужение разностной гистограммы наблюдается только при 95% ингибировании хемилюминесценции (Шаталин Ю.В., и др. 2008).
В результате исследований было обнаружено, что концентрация антиоксиданта, необходимая для снижения ХЛ-ответа в клеточной системе, на порядок больше, чем в модельной биохимической системе. При действии гидрофобного антиоксиданта на клетки, происходит частичное распределение его в липидной компоненте мембраны, тем самым увеличивается концентрация антиоксиданта, требуемая для снижения АФК в водной фазе.
Рис.8 Типичные кривые изменения уровня РФК в максимуме хемилюминесценции в системе, содержащей фагоцитирующие клетки кровеносного русла здорового животного, при добавлении различных концентраций дигидрокверцетина (АРА).
Рис.9 Типичные кривые хемилюминесценции в системе, содержащей фагоцитирующие клетки здорового животного, при добавлении дигидрокверцетина.
Основные реакции, протекающие при этом в растворе, сопровождаются образованием более стабильных форм кислорода. Так для реакции с участием хиноновой группировки флавоноида происходит перенос электрона с супероксид аниона на антиоксидант:
O2– + A = O2 + A– •,
где А –хиноновая группировка флавоноида, а A– • - семихинонная форма хиноновой группировки.
(O2– - ē = O2 ; E○pH 7 = 560 мВ)
Реакции с участием аскорбиновой кислоты, α-токоферола как и ДГК так же может протекать через стадию элиминирования с образованием пероксида водорода:
O2– + AH + H2O = H2O2 + A– • (•) + OH-,
где AH / A– •(•) – восстановленная / окисленная форма антиоксиданта
(O2– + H2O + ē = HO2– +OH– ; E○щел = 408 мВ, E○pH 7 = 822 мВ)
Окислительно-восстановительные потенциалы антиоксидантов приведены в таблица 4.
Тем не менее, реакция будет протекать, если будет выполняться следующее соотношение:
ln(Keq) = ln((A– •)(O2(H2O2))/(A(AH))(O2– )) > 0;
В данном выражении, при прочих равных условиях, для исследуемых антиоксидантов соотношением (O2(H2O2))/(O2–) можно пренебречь. Соотношение же (A–•)/(A(AH)) сильно зависит от растворимости исходных антиоксидантов в водной фазе - чем она ниже, тем ниже и ΔG, при условии (A–•) << (A(AH)). Следовательно, величина ΔG (энергия Гиббса) при одинаковых условиях генерации АФК будет зависеть от концентрации антиоксиданта в водной фазе (A(AH)), которая, в свою очередь, зависит от константы распределения антиоксиданта между водной и липидной фазой, а так же от скорости диффузии из одной фазы в другую.
Низкая растворимость ДГК приводит к тому, что действующая концентрация антиоксиданта, находящаяся в водной фазе, значительно ниже, чем добавляемая в систему. Тем не менее, благодаря этим свойствам, данные соединения должны обладать высокой защитной способностью от перекисного окисления липидов, обрывая ветвление свободно радикальной цепи.
Сравнение потенциала окислительно-восстановительной реакции (термодинамическая составляющая), в которой участвует ДГК и растворимость в водной фазе (кинетическая составляющая) показало, что при исследовании АОА и АРА необходимо учитывать оба эти параметра. Низкий потенциал полуреакции восстановления хиноновой группировки до семихиноновой формы указывает на возможность обратной реакции, что проявляется, в ряде случаев, в виде наличия прооксидантных свойств.
Как видно из таблицы 4, ДГК обладает высокой антирадикальной активностью в биохимической модельной системе, и по своим свойствам сравним с аскорбиновой кислотой.
Таблица 4. Антиоксидантные свойства дигидрокверцетина в “биохимической” и “клеточной” системах. САРА – концентрация, соответствующая антирадикальной активности соединения; САОА – концентрация, соответствующая антиокислительной активности соединения; БХС – биохимическая модельная система (пероксидаза хрена – люминол – H2O2); ФС – фагоцитсодержащая модельная система (лейкоциты крови здорового животного – люминол - ФМА).
| Антиоксиданты | САРА в БХС | САОА в БХС | САРА в ФС | САОА в ФС |
| α-токоферол | 2,24х10-5 | 3,41х10-5 | 2,43х10-4 | 3,14х10-5 |
| ДГК | 2,0х10-7 | 1,7х10-6 | 3,3х10-5 | 5,0х10-6 |
| АК | 1,8х10-7 | 5,2х10-7 | 1,1х10-5 | 1,7х10-6 |
3.2 ПРООКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА
Следующим этапом нашей работы стало изучение антиоксидантной активности ДГК системе в которой в качестве катализатора выступало железо(III). В данной системе существует возможность реализации прооксидантного эффекта по механизму представленному справа. Нами был обнаружен эффект усиления уровня АФК по сравнению с контролем (рис 11). Т.е. в определенных концентрационных соотношениях был обнаружен мах прооксидантный эффект при Fe3+ = 200 мкМ (рис 13) и ДГК = 3 мкМ (рис 12).
Рис.12 Зависимость ХЛ-ответа от С(ДГК)
Рис.13 Зависимость ХЛ-ответа от С(Fe3+)
Сходные результаты были получены нами при переходе на систему генерации АФК перитонеальными макрофагами в присутствии железа. Это говорит в пользу того что протекающая реакция восстановления железа до активного двухвалентного состояния реализуется как в химической, таки и клеточной модельной системе. На рис. 14 показана трехмерная диаграмма с максимальным прооксидантным эффектом наблюдаемым при Fe3+ = 200 мкМ (рис 16) и ДГК = 3 мкМ (рис 15), что аналогично химической модельной системе: люминол-H2O2- Fe3+.
Рис.15 Зависимость ХЛ-ответа от С(ДГК)
Рис.16 Зависимость ХЛ-ответа от С(Fe3+)
Влияние рН на процесс окисления липида в присутствии ДГК и его комплекса с железом (II).
3.3 РОЛЬ PH СРЕДЫ НА ПРО- И АНТИОКСИДАНТНУЮ АКТИВНОСТЬ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА И ЕГО КОМПЛЕКСА ДГК-FE3+
Использование данной модельной системы: люминол-H2O2-катализатор, не является оптимальной для изучения про/антиоксидантых свойств гидрофобных соединений вследствие слабой растворимости в воде и высокого коэффициента распределения октанол-вода (для дигидрокверцетина LogP =1 .82±0.41). Поэтому в дальнейшем нами была использована модель окисления лецитина под действием кислорода воздуха и пероксида водорода.
В процессе реакции ДГК с активными формами кислорода (АФК) образуются промежуточные формы обладающие как про- так и антиоксидантной активностью (схема 1). Как видно из схемы под действием АФК наблюдается отрыв протона с образованием семихиноновой формы ДГК (I). Стабильность данной формы выше в условиях высоких концентраций ДГК и при высоких значениях pH, что приводит к образованию димерных форм семихинонов с распределением заряда. Дальнейшее окисление под действием АФК приводит к образованию хинона (II), который так же частично образуется в процессе реакции диспропорционирования. Хиноновая и семихиноновая формы проявляют прооксидантный эффект и способны генерировать АФК или отрывать по гомолитическому разрыву слабые водородные связи, преимущественно от гидроксильных групп. При низких значениях pH, окисление ДГК направляется по другому пути с образованием стабильных феноксильных радикалов, способных проявлять как прооксидантные, так и антиоксидантные свойства (III, IV).
Схема 1. Окислительно-восстановительные превращения дигидрокверцетина
Образующиеся феноксильные или генерируемые опосредовано через хиноновую/семихиноновую формы радикалы способны участвовать в реакции с липидом с образованием различных карбоксильных соединений а так же увеличение непредельных групп в липиде (схема 2). Как видно из схемы гомолитических отрыв C-H связи возможен только в присутствие высокоэнергитических гидроксил радикалов. Дальнейшие стадии образования спиртовой группы и дегидратация может протекать в присутствии более слабых окислителей. Дальнейшее окисление, сопровождающееся разрывом двойных связей и окислением их до соответствующих карбонильных соединений, протекает в присутствии пероксидов и катализируется в присутствии металлов переменной валентности, способных образовывать π-комплекс.
Схема 2. Основные пути формирования непредельных групп в липиде и образование альдегидов в процессе окисления
Нами было обнаружено, что в процессе окисления липида в присутствии ДГК, наблюдается накопление всех карбонильных производных, причем образование монокарбонильных соединений существенно ингибируется с ростом концентрации ДГК, относительно контрольного образца липида (данные не представлены). Тем не менее, накопление основного продукта, малонового диальдегида, от концентрации ДГК в липиде, имеет сложную зависимость (рис. 17 a).
Максимальное накопление малонового диальдегида в присутствии ДГК приходилось на 6-8 сутки, при этом доза зависимое ингибирование накопления МДА наблюдалось только в период до 4-х суток. Изменив систему окисления липида, добавив в качестве катализатора ПОЛ ионы металла переменной валентности, можно попытаться ответить на вопрос - является ли подобное изменение следствием прооксидантного эффекта ДГК.