| гормон | Концентрация, мг/л | В начале пассажа | В конце пассажа | h2-h1 | Кол-во листьев2-кол-во листьев1 | |||
| h1 | Кол-во листь ев1 | h2 | Кол-во листьев2 | Коэф.размноже ния | ||||
| 1,5 | 3 | 3,1 | 3 | 1 | 1,6 | 0 | ||
| 2,4 | 4 | 4 | 4 | 1 | 1,6 | 0 | ||
| 0,4 | 2,5 | 3 | 3,1 | 4 | 1 | 0,6 | 1 | |
| 2,6 | 4 | 4 | 5 | 1 | 0,4 | 1 | ||
| 2,5 | 4 | 3,7 | 4 | 1 | 1,2 | 0 | ||
| ГБК | Среднее значение | 2,3 ±0,2 | 3,6 ±0,2 | 3,6 ±0,2 | 4 ±0,3 | 1 | 1 ±0,3 | 0,4 ±0,2 |
| 2,8 | 2 | 4,7 | 3 | 1 | 1,9 | 1 | ||
| 1,3 | 3 | 6,7 | 3 | 1 | 5,4 | 0 | ||
| 0,2 | 1,9 | 5 | 4,2 | 5 | 1 | 2,3 | 0 | |
| 1,6 | 3 | 1,8 | 4 | 1 | 0,2 | 1 | ||
| 1,1 | 6 | 1,5 | 8 | 2 | 0,4 | 2 | ||
| Среднее значение | 1,7 ±0,3 | 3,8 ±0,7 | 3,8 ±0,9 | 4,6 ±0,9 | 1,2 ±0,2 | 2 ±0,8 | 0,8 ±0,4 | |
Таблица № 4Влияние гормона 6-бензиламинопурин на регенерацию и рост побегов Майкарагана волжского.
1-ая повторность.
| гормон | Концентрация, мг/л | В начале пассажа | В конце пассажа | |||
| h1 | Кол-во листьев1 | h2 | Кол-во листьев2 | Коэф. размноже ния | ||
| 3 | ||||||
| 4 | ||||||
| 1 | 3 | |||||
| 5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 6-БАП | Среднее значение | 3,8 ±0,5 | ||||
| 2 | ||||||
| 7 | ||||||
| 0,1 | 3 | |||||
| 1 | ||||||
| 1 | ||||||
| Среднее значение | 4 ±1 | |||||
| 3 | ||||||
| 2 | ||||||
| 0,5 | 2 | |||||
| 3 | ||||||
| 1 | ||||||
| Среднее значение | 2,5 ±0,3 | |||||
2-ая повторность
| гормон | Концентрация, мг/л | В начале пассажа | В конце пассажа | |||
| h1 | Кол-во листь ев1 | h2 | Кол-во листьев2 | Коэф. размноже ния | ||
| 1 | ||||||
| 4 | ||||||
| 1 | 5 | |||||
| 3 | ||||||
| 3 | ||||||
| 6-БАП | Среднее значение | 3,8 ±0,5 | ||||
| 1 | ||||||
| 2 | ||||||
| 0,1 | 6 | |||||
| 4 | ||||||
| 2 | ||||||
| Среднее значение | 3 ±0,9 | |||||
| 1 | ||||||
| 3 | ||||||
| 0,5 | 2 | |||||
| 4 | ||||||
| 2 | ||||||
| Среднее значение | 2,4 ±0,5 | |||||
Таблица № 5 Влияние различных цитокининов на коэффициент размножения Майкарагана волжского.
| Регулятор роста | Концентрация, мг/л | Коэффициент размножения | |
| 1-ая повторность | 2-ая повторность | ||
| Кинетин | 1,0 | 1,6±0,6 | 1,6±0,2 |
| 2,0 | 2,4±0,2 | 2,6±0,2 | |
| 5,0 | 1,8±0,8 | 1,8±0,3 | |
| Зеатин | 0,1 | 1 | 1 |
| 0,5 | 1,4±0,4 | 1,4±0,2 | |
| 1,0 | 1 | 1 | |
| 6-БАП | 0,1 | 3,8±0,5 | 3,8±0,5 |
| 0,5 | 4±1 | 3±0,9 | |
| 1,0 | 2,5±0,3 | 2,4±0,5 | |
Таблица № 6 Влияние цитокининов и гибберелловой кислоты на регенерацию и рост побегов Майкарагана волжского в культуре in vitro.
| Регулятор роста | Концентрация, мг/л | Коэффициент размножения | Кол-во листьев, шт. | Линейный рост, см | |||
| 1-ая повтор- ность | 2-ая повтор- ность | 1-ая повтор-ность | 2-ая повтор-ность | 1-ая повтор-ность | 2-ая повтор-ность | ||
| 0,1 | 1 | 1 | 0,8±0,4 | 0,6±0,4 | 0,4±0,1 | 0,5±0,1 | |
| Зеатин | 0,5 | 1,4±0,4 | 1,4±0,2 | 1,4±0,5 | 1±0,4 | 0,6±0,3 | 0,9±0,4 |
| 1 | 1 | 1 | 2,6±1,2 | 2,2±0,8 | 0,54±0,2 | 0,6±0,2 | |
| 1 | 1,6±0,6 | 1,6±0,2 | 0,8±0,4 | 1±0,3 | 2,34±0,6 | 2,3±0,5 | |
| Кинетин | 2 | 2,4±0,2 | 2,6±0,2 | 1,2±,09 | 0,8±0,2 | 3,94±1,2 | 3,94±1,2 |
| 5 | 1,8±0,8 | 1,8±0,3 | 1,2±0,8 | 1±0,4 | 2,32±0,4 | 2,3±1,6 | |
| ГБК | 0,2 | 1 | 1 | 1±0,5 | 0,8±0,4 | 1,8±1 | 2±0,8 |
| 0,4 | 1 | 1,2±0,2 | 0,6±0,2 | 0,4±0,2 | 1,02±0,2 | 1±0,3 | |
В качестве вторичных эксплантов брались фрагменты побега длиной 7-10 мм. Оптимальным временем пассажа для Майкарагана волжского является 30-35 дней. В дальнейшем увеличения коэффициента размножения не происходило, и замедлялись темпы роста. Кроме того, у значительной части растений in vitro начинали подсыхать листья.
Из всех цитокининов наибольший коэффициент размножения наблюдался при использовании в качестве гормона 6-БАП. (табл. №5). Однако при этом происходили изменения в морфологии побегов: междоузлия побегов сократились, уменьшились размеры листьев, изменилась их форма. Кроме того, у половины побегов при концентрации 1.0 мг/л 6-БАП наблюдалась витрификация побегов (остекленение). При пересаживании растений-регенерантов на среды с меньшей концентрацией не все растения принимали нормальную морфологию.
Кинетин оказывал стимулирующее действие на регенерационные процессы в широком диапазоне концентраций (от 1.0 до 5.0 мг/л). Под его действием коэффициент размножения составил от 1,6 до 2,4. Растения-регенеранты были нормальной морфологии и за пассаж выросли на 1,9 – 2,3 см (табл. №6).
Полученные результаты продемонстрировали нецелесообразность использования в качестве цитокининов зеатина, так как индуцировать регенерацию побегов удалось не у всех эксплантов, стебли растений были очень тонкие, намного уменьшались размеры листьев.
Нецелесообразным оказалось использование гибберелловой кислоты на этапе вытягивания побегов перед укоренением. Линейный рост при концентрации 0,2 мг/л составил 0,3 см, а при 0,4 мг/л – 1,1 см (табл. №6) в то время как при использование кинетина линейный рост составил от 1,9 до 2,3 см. При выращивании побегов на среде с кинетином не требуется помещать их на среду с другим составом для вытягивания побегов, так как они и так уже с вытянутыми междоузлиями. Таким образом, нам удалось сократить процесс микроклонального размножения на один этап.
Общее количество растений-регенерантов можно повысить, если применить в сочетании два метода: культуру пазушных почек и выращивание растений из первичного каллуса. В качестве доноров экспланта при получении каллуса использовали корни, гипокотиль и семядольные листья. Изучали два варианта питательных сред, в составе которых присутствовали регуляторы роста 2,4-Д, ИУК и 6-БАП, а также ЩУК и повышенные концентрации сахарозы. Каллус индуцировали в условиях темноты. Наличие ауксина и цитокинина явилось обязательным условием для получения активно растущей каллусной культуры, так как на среде без экзогенных регуляторов роста процессы пролиферации не происходили. Частота индукции (возникновения) каллуса на всех изучаемых средах составила 100 %. Однако темпы пролиферации каллуса различались и зависели как от состава среды так и от экспланта. Так на семядольных листьях каллус вообще не возникал, на корнях наблюдалось возникновение небольших очагов. На гипокотиле образовывался хорошо растущий, морфогенный каллус. Побеги полученные в каллусной культуре переносили на питательную среду другого состава и на свет.
Выводы
1. Оптимальным стерилизующим средством на этапе введения в культуру следует считать «Лизоформин» в концентрации 3 %.При его использовании наблюдалась 100 % стерилизация семян.
2. Экспериментально доказано, что из всех использованных цитокининов лучшим индуктором побегообразования является кинетин. Он оказал стимулирующее действие на регенерационные процессы в широком диапазоне концентраций (от 1 мг/л до 5 мг/л).
3. Использование кинетина позволило сократить процесс клонального микроразмножения на один этап, так как не требовалось помещать растения перед укоренением на среду для вытягивания.
4. Наибольший коэффициент размножения наблюдался при использовании 6-БАП при концентрации 0,1 мг/л.
5. Эффективным оказалось сочетание метода культуры пазушных почек и выращивание растений из первичного каллуса. В этом случае регенеранты, полученные первым методом, выступают в качестве растений- доноров эксплантов, используемых для получения каллуса.
Таким образом, результаты проведенных исследований показывают реальную возможность использования методов биотехнологии для введения в культуру и сохранения вида. Считаем необходимым продолжить исследования по данной тематике.