Для стабилизации аналитического сигнала путем вывода из реакции не прореагировавших ионов Fe+3 в реакционную смесь вводили «стоп-реагент», в качестве которого применяли комплексообразователи: фторид натрия и ЭДТА в диапазоне концентраций 0,06 мМ – 0,01 М, 0,03 мМ – 0,1 мМ соответственно.
В ходе эксперимента установлено, что введение в реакционную систему более 0,05 мМ ЭДТА приводит к уменьшению во времени аналитического сигнала аскорбиновой кислоты и (или) фенольных антиоксидантов, используемых в качестве восстановителя. Введение ЭДТА в меньших концентрациях приводит к получению стабильного во времени аналитического сигнала для индивидуальных восстановителей, однако при этом не стабилизируется сигнал реальных объектов.
Для большинства изучаемых восстановителей введение в реакцию 0,01 М фторида натрия обеспечивает стабильный во времени аналитический сигнал (таблица 3). В случае танина и рутина наблюдается незначительное нарастание аналитического сигнала во времени.
В аналогичных условиях были получены стабильные во времени аналитические сигналы для реальных объектов, таких как сухое вино, пиво, соки, чай, экстракты лекарственных растений. Это позволило рекомендовать фторид натрия в качестве «стоп-реагента» при определении антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов.
Таблица 3 – Зависимость аналитического сигнала восстановителя от его концентрации во времени в присутствии 0,01 М NaF *
| Восстановитель | τ, мин | Уравнения регрессии | R2 |
| Аскорбиноваякислота | 15 | y = 0,2619x – 0,0032 | 0,9996 |
| 30 | y = 0,2624x – 0,0035 | 0,9996 | |
| 60 | y = 0,2626x – 0,0024 | 0,9996 | |
| 90 | y = 0,2628x – 0,0032 | 0,9996 | |
| Танин | 15 | y = 0,1871x + 0,0012 | 0,9999 |
| 30 | y = 0,1917x + 0,0009 | 0,9997 | |
| 60 | y = 0,1963x + 0,0019 | 0,9998 | |
| 90 | y = 0,2013x + 0,0038 | 0,9997 | |
| Рутин | 15 | y = 0,1301x – 0,0012 | 0,9999 |
| 30 | y = 0,1327x – 0,0002 | 0,9999 | |
| 60 | y = 0,1384x – 0,0004 | 0,9999 | |
| 90 | y = 0,1425x + 0,0017 | 0,9999 | |
| Кверцетин | 15 | y = 0,3813x – 0,0012 | 0,9986 |
| 30 | y = 0,3818x – 0,0010 | 0,9982 | |
| 60 | y = 0,3826x – 0,0005 | 0,9983 | |
| 90 | y = 0,3837x – 0,0006 | 0,9983 | |
| Галловаякислота | 15 | y = 0,5537x + 0,0030 | 0,9987 |
| 30 | y = 0,5546x + 0,0032 | 0,9986 | |
| 60 | y = 0,5557x + 0,0036 | 0,9986 | |
| 90 | y = 0,5563x + 0,0026 | 0,9986 | |
| Гидрохинон | 15 | y = 0,3531x + 0,0049 | 0,9996 |
| 30 | y = 0,3535x + 0,0048 | 0,9997 | |
| 60 | y = 0,3541x + 0,0043 | 0,9996 | |
| 90 | y = 0,3543x + 0,0045 | 0,9997 | |
| Цистеин | 15 | y = 0,0993x – 0,0068 | 0,9976 |
| 30 | y = 0,0997x – 0,0066 | 0,9980 | |
| 60 | y = 0,1004x – 0,0065 | 0,9985 | |
| 90 | y = 0,1004x – 0,0065 | 0,9982 | |
| Глутатион | 15 | y = 0,0168x – 0,0021 | 0,9928 |
| 30 | y = 0,0168x – 0,0023 | 0,9930 | |
| 60 | y = 0,068x – 0,0024 | 0,9927 | |
| 90 | y = 0,0168x – 0,0023 | 0,9930 |
* «стоп-реагент» вводился в реакционную смесь через 60 мин после начала реакции
Проведенная оптимизация условий определения АОА: состав и объем вводимого комплексного реагента, выбранный комплексообразователь и его концентрацию, а также время выдерживания до и после введения «стоп-реагента», позволил предложить алгоритм методики определения антиоксидантной активности растительных материалов и пищевых продуктов. Комплексный реагент состава 6 мМ Fe(III) и 10 мМ о-фенантролина смешивают с исследуемым образцом (разбавление и объем которого будут зависеть от его антиоксидантной активности), выдерживают фиксированное время, по истечение которого реакцию останавливают добавлением «стоп-реагента» и через установленное время измеряют оптическую плотность испытуемого раствора при характеристической длине волны. Антиоксидантную активность пищевых продуктов и растительного сырья выражают количеством вещества-стандарта (аскорбиновой кислоты), производящим антиоксидантный эффект, эквивалентный действию суммы восстановителей изучаемого образца (в мг аскорбиновой кислоты на г (см3) продукта).
Различные группы пищевых продуктов отличаются по химическому составу и, в том числе, по содержанию восстановителей, поэтому их антиоксидантные свойства могут сильно отличаться. Это приводит к необходимости оптимизации условий определения антиоксидантной активности реальных объектов. Кроме того, известно, что разбавление может привести к изменению вещественного состава образца, в частности, за счет протекания реакций гидролиза.
Оптимизацию определения антиоксидантной активности проводили на образцах пищевых продуктов по единой методологии, заключающейся в рассмотрении изменения аналитического сигнала пробы при различном разбавлении и времени выдерживания до введения в реакцию. Критериями оптимальности служили неизменность аналитического сигнала после разбавления пробы при ее выдерживании в течение 60 мин, стабильный в течение длительного времени (до 120 мин) аналитический сигнал после введения «стоп-реагента», а также пропорциональное изменение сигналов при разбавлении.
Так, например, для образцов вина, разбавленных менее чем в 100 раз, наблюдается уменьшение аналитического сигнала пробы в среднем на 12 % при выдерживании в течение часа. При введении в реакцию разбавленных в соотношении 1:100 и 1:200, а также неразбавленных (вводимый объем 0,02 см3) образцов аналитический сигнал стабилен после введения «стоп-реагента» и пропорционально возрастает с увеличением объема пробы.
Проведенные исследования для различных групп пищевых продуктов позволили оптимизировать разбавление и объем пробы, вводимый в реакцию (таблица 4), и рекомендовать внесение ее сразу после разбавления.
По разработанной методике были проанализированы сухие красные и белые вина, пиво, восстановленные и свежеотжатые фруктовые соки, чай и растительное сырье (таблица 5). Полученные результаты показывают, что величина их антиоксидантной активности варьируется в широком диапазоне.
Таблица 4 – Оптимизированные разбавление и объем пробы, вводимой в реакцию
| Объект исследования | Разбавление образца | Объем пробы, вводимый в реакцию, см3 |
| Вино | 1 : 100, 1 : 200 | 1,0 – 2,0 |
| Пиво | 1 : 20 | 1,0 – 2,5 |
| Сок | 1 : 5 | 0,2 – 1,0 |
| Чай | 1 : 50, 1 : 100 | 1,0 – 2,0 |
Таблица 5 – Антиоксидантная активность ряда образцов растительного сырья и пищевых продуктов (n = 6, P = 0,95)
| Объект исследования | Характеристика объекта | АОА, мгАК/г |
| Сухие вина: | ||
| Каберне Фанагории | ОАО АПФ «Фанагория» | 3,7 ± 0,1 |
| Каберне Абрау | вино невыдержанное ООО «Кубань – Вино» | 2,3 ± 0,1 |
| Каберне | ООО «Мильстрим – Черноморские вина» | 2,0 ± 0,1 |
| Каберне | ООО «Инвинком», Молдова | 2,0 ± 0,1 |
| Мускат | ООО «Инвинком», Молдова | 0,29 ± 0,05 |
| Шардоне | ЗАО Агрофирма «Мысхако» | 0,23 ± 0,02 |
| Пиво: | ||
| Балтика №3 | светлое, ОАО «Пивоваренная компания«Балтика» | 0,21 ± 0,01 |
| Балтика №6 | темное, ОАО «Пивоваренная компания «Балтика» | 0,50 ± 0,01 |
| Чай: | ||
| Майский | сорт высший, ООО «Май» | 134 ± 7 |
| Краснодарский | сорт второй, ЗАО «Дагомысчай» | 60 ± 3 |
| Соки восстановленные: | ||
| Яблочный | ОАО «Лебедянский» | 0,51 ± 0,04 |
| Апельсиновый | ОАО «Лебедянский» | 2,2 ± 0,2 |
| Растительное сырье: | ||
| крапива | ОАО «Красногорсклексредства» | 21 ± 1 |
| эхиноцея пурпурная | ОАО «Красногорсклексредства» | 28 ± 1 |
3 Антиоксидантная активность пищевых продуктов как обобщающая характеристика показателя их качества
Представляло интерес сопоставить известные суммарные показатели конкретных пищевых продуктов, характеризующие их восстановительные свойства, с величиной АОА, определяемой по разработанной методике.
Для ряда пищевых продуктов можно выделить преобладающую группу восстановителей органической природы. Например, антиоксидантные свойства вина в основном обусловлены фенольными соединениями, включающими катехины, антоцианы, флавонолы, лейкоантоцианы, танины, пива – водорастворимыми компонентами солода и хмеля (экстрактивными веществами). Основной вклад в величину антиоксидантной активности чая, вероятно, вносят полифенольные соединения (танины). Кроме того, в чае присутствуют замещенные фенолы (галловая кислота, кверцетин, рутин), способные взаимодействовать с индикаторной системой Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин. Это и обусловило выбор объектов исследования – сухое красное вино, пиво, чай – для проведения сопоставительного анализа.
Было определено суммарное содержание фенольных соединений в сухих красных винах спектрофотометрическим методом с использованием реактива Фолина – Чокальтеу и суммы экстрактивных веществ пива и чая в соответствии с ГОСТ 12787-81 и 28851-90. Установлена взаимосвязь между суммарной антиоксидантной активностью и этими показателями. Зависимость между антиоксидантной активностью и содержанием экстрактивных веществ для образцов, на примере пива, приведена на рис. 1. Для образцов вина наблюдается не только взаимосвязанное изменение антиоксидантной активности и концентрации фенольных соединений, но и довольно близкие значения этих суммарных показателей (таблица 6).