Основным препятствием на пути широкого внедрения в практику вирусных препаратов является трудность культивирования вирусов как облигатных паразитов. Характерной особенностью их производства является размножение вирусов в живых клетках. Для получения вирусных инсектицидов используются соответствующие насекомые-вредители. Но насекомые, предназначенные для размножения вирусов, отнюдь не являются стерильными, они населены разнообразной микрофлорой, в том числе и вирусами. В связи с этим при производстве вирусных инсектицидов необходим строгий и постоянный контроль их, качества. Присутствие в насекомых посторонней микрофлоры приводит к снижению качества препаратов. Кроме того, в процессе производства этих препаратов приходится заражать вирусом большое количество насекомых, а затем извлекать его из массы погибших личинок. Все это сказывается на стоимости и качестве препарата.
В связи с отмеченными трудностями ученые задались целью выяснить, нельзя ли использовать для производства вирусов метод культуры клеток животных. Ведь преимущества этого метода очевидны: клетки могут быть избавлены от посторонней микрофлоры, они однородны, размножаются стабильно.
Первые попытки культивирования клеток насекомых были предприняты в начале XX в. Однако длительное время среди ученых было распространено мнение, что выращивание клеток беспозвоночных в культуре не имеет практического значения. По этой причине исследования в области культуры клеток насекомых велись недостаточно активно. Интенсивные исследования проблемы начались в 60-х годах, когда Т. Д. Грейс получил первые четыре перевиваемые линии из тканей яичников эвкалиптового шелкопряда. В 1976 г. уже насчитывалось более 120 перевиваемых линий клеток насекомых, а к 1983 г. их количество превысило 200.
Для получения клеточных линий используют первичные культуры эмбрионов, гомоцитов, яичников, имагинальных дисков, жировых тел, мацерированных личинок, куколок или имаго. Доказано, что личинки и куколки насекомых — лучшие источники получения культивируемых клеток. Методика получения первичных культур клеток насекомых достаточно отработана. Она включает следующие этапы:
—стерилизация поверхности насекомых и подлежащих культивированию тканей;
—диссоциация клеток;
—пересадка их на питательную среду.
Срок жизни первичных клеточных культур ограничен. Через определенное время культура стареет, что проявляется в грануляции цитоплазмы, сморщивании и округлении клеток, потери связей между клетками и твердым субстратом. Усилия вирусологов направлены на получение стабильных клеточных линий, т. е. клеток, способных культивироваться на искусственных питательных средах до бесконечности. В настоящее время получены стабильные (перевиваемые) клеточные линии таких важных вредителей сельского и лесного хозяйства, как непарный шелкопряд, капустная металловидка, хлопковая и табачная совка и др.
Для нужд медицины и здравоохранения разработано заводское оборудование для массового производства клеток позвоночных животных invitro. Эта технология, по мнению специалистов, может быть использована с небольшими модификациями и для культивирования клеток насекомых.
В настоящее время выпускается несколько препаратов, содержащих энтомопатогенные вирусы. Это прежде всего ряд отечественных препаратов типа вирин: вирин-ЭНШ против непарного шелкопряда, вирин-АББ против американской белой бабочки, вирин-ЭКС против капустной совки, вирин-ЯМ против яблоневой моли, вирин-КШ против кольчатого шелкопряда, вирин-ГЯП — против яблонной плодожорки, вирин-ХС против хлопковой совки и препарат элкар против совок из рода. Heliothis.
Наряду с вирусами для борьбы с вредными насекомыми используются бактерии. Наибольшее практическое значение в деле организации борьбы с насекомыми-вредителями имеет бактерия В. fburingiensis, она составляет основу "современной промышленности по производству бактериальных, инсектицидов. В. thuringiensis объединяет разновидности спорообразующих бактерий, вырабатывающих особые энтомоцидные токсины, обладающие высокой активностью по отношению к насекомым. Эти токсины могут быть двух видов: кристалловидный и растворимый.
Кристаллы первого типа имеют ромбовидную (тетрагональную) форму. Они обнаруживаются в клетках в процессе споруляции с помощью обычного светового микроскопа. Их часто называют параспоральными включениями или эндотоксинами. После завершения спорообразования кристаллы попадают в питательную среду, где обнаруживаются в свободном виде. По химической природе кристаллы представляют собой термолабильные белковые вещества, разрушаемые при температуре 60°. Бактерии, продуцирующие кристалловидный токсин, обитают среди микрофлоры кишечника различных насекомых. Выделенный из них токсин, будучи введен в гусениц чешуекрылых насекомых, вызывает паралич кишечника. Насекомые гибнут при обработке их растворами очень слабой концентрации— 1:106.
Некоторые разновидности В. thuringiensisобразуют энтомоцидный низкомолекулярный токсин нуклеотидной природы, называемый экзотоксином, который в отличие от кристалловидного токсина находится в культуральной жидкости в растворенном состоянии и не разрушается при кипячении. В составе его имеются два родственных вещества, названные тюрингиензинами А и В. Экзотоксин отличается от кристалловидного токсина меньшей специфичностью — он активен по отношению ко многим видам насекомых. Препараты обоих токсинов безвредны для теплокровных животных, рыб и растений.
В нашей стране и за рубежом из В. thuringiensis в промышленных масштабах изготовляют ряд препаратов, предназначенных для борьбы с вредными насекомыми. Из зарубежных препаратов известны биотрол, турицид, агритрол, бактан, дипел, бактоспейн и др. Мировое производство препаратов из В. thuringiensis в 1979 г. составляло более 1200 т, что позволяет обработать площадь посевов в несколько миллионов гектаров.
В США инсектициды на основе В. thuringiensis производятся компанией «Сельскохозяйственные продукты Монсанто» («Monsanto. AgriculturalProducts»). Фермеры в течение двадцати лет используют эти препараты для защиты таких культур, как капуста, хлопчатник, бобы, картофель.
В Росии созданы, применяются или проходят испытание следующие препараты: дендробациллин, энтобактерин, инсектин, гомелин, битоксибациллин (БТБ-202), бактериальный инсектицидный препарат (БИП), алестин, туверин-2, лепидоцид, инсектин-2. Они поражают свыше 200 видов вредных насекомых. Промышленное изготовление бактериального препарата энтобактерина осуществляется в нашей стране еще с 1959 г.
Бактериальные инсектициды обычно выпускаются в виде порошка. Это удобная для транспортировки, хранения и использования форма. Против ряда вредителей, применяются гранулированные и инкапсулированные формы бактериальных препаратов. Так, например, для борьбы с кукурузным мотыльком успешно используются препараты, в гранулах с кукурузной мукой.
Для повышения эффективности бактериальных инсектицидов употребляются различные- добавки — растекатели, прилипатели. или распылители. Препараты содержат споры бактерий и кристаллы эндотоксина, а в некоторых случаях (препарат битоксибациллин) и термостабильныи токсин с помощью которого удается расширить спектр действия препаратов. Эти препараты можно комбинировать с сублетальными дозами химических инсектицидов, а именно некоторых карбаматов, фосфорорганических препаратов, пиретроидов, с препаратами энтомопатогенных вирусов, о которых говорилось выше. В нашей стране дендробациллин, энтобактерин, инсектин, гомелин, битоксибациллин используют в смеси с хлорофосом, золоном, фосфамидом, севином, бензофосфатом, фозолоном, метатионом, метафосом, полидофеном, рогором, карбофосом против непарного и кольчатого шелкопрядов, яблонной и капустной молей, плодожорок, боярышниковой и розанной листоверток, хлопковых и капустных совок, боярышницы, шелкопряда-монашенки, комплекса пядениц, дубовой листовертки, лугового мотылька, красногрудой пьявицы, бересклетовой и японской восковой ложнощитовок, шишковой огневки. Химические добавки вряде случаев повышают эффективность биопрепаратов на 20—30%или не изменяют ее. Причины отсутствия эффекта придобавлении к биопрепаратам ядохимикатов еще не выяснены, однако в целом ряде случаев отмечено отрицательное влияние химических добавок на жизнеспособность спор В. thuringiensis (в случае фосфорорганических инсектицидов, алдрина, гепта-хлора). Вместе с тем ряд препаратов оказался совместимым с бактериями. Эти препараты могут быть рекомендованы к использованию при осуществлении интегрированной защиты растений от вредных насекомых (ортен, дилокс, ланнот, цетран, димелин).
С целью повышения эффективности бактериальных препаратов пытаются использовать особые клеющие вещества. Производственную проверку успешно прошел прилипатель поливинилацетат идрожжевая бражка в концентрации 1 %. Добавление к препарату В. thuringiensis фермента хитиназы, ускоряющего гидролиз хитинового покрова насекомых, ускоряет гибель еловой листовертки. Помимо хитиназы хороший эффект дает димелин, который подавляе 'образование хитина у гусениц и удлиняет межлиночный период. Наряду с В. thuringiensis для борьбы с вредными насекомыми могут быть использованы и некоторые другие бактерии. Так, например, культуры В. popilliae являются эффективным средством борьбы с японским жуком — опасным вредителем, поражающим около 300 видов растений. Бактерия вызывает так называемую молочную болезнь вредителя. Для практических надобностей бактерии выращивают непосредственно в организме личинок японского жука. Погибших личинок вносят в почву, где споры бактерий в течение длительного времени сохраняют жизнеспособность и вирулентность. Детальное изучение биологических особенностей этих бактерий позволит успешно культивировать их на искусственных питательных средах и изготовлять бактериальные инсектициды в больших количествах. Они могут быть использованы для борьбы с вредными жуками и другими насекомыми, против которых ныне используемые средства малоэффективны.