Для приготовления плотной среды Хоттингера с триптоном, глюкозой и дрожжевым экстрактом в 1 дмЗ бульона Хоттингера вносят 0,5 г дрожжевого экстракта или 2,5 смЗ раствора дрожжевого экстракта, 5 г глюкозы, 5 г триптона, 15-20 г агара, устанавливают рН среды (7,1+0,1) и стерилизуют ее при температуре (121±1)°С в течение 20 мин. Перед употреблением в расплавленную стерильную среду асептически вносят 0,6 г аскорбиновой кислоты.
Приготовление среды Крумведе-Олькеницкого в модификации Ко-валъчука
В 1 дм3 дистиллированной воды растворяют I г гипосульфита, 0,6 г соли Мора, 10 г мочевины, 15 г лактозы х.ч., 3,5 г сахарозы и 2 г глюкозы. Устанавливают рН среды до 7,4 - 7,6. Добавляют 46 г сухой среды с сахарозой и индикатором ВР. Все размешивают, кипятят в водяной бане в течение 40 мин. Разливают в пробирки по 5 - 6 см3. Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют 20 мин при давлении 5104 Па. После стерилизации среду скашивают так, чтобы в пробирке остался столбик высотой не менее 3 см.
Приготовление среды ХБ (хинозол-бромкрезол-пурпурной)
Для приготовления бромкрезол-пурпура 0,8 г порошка заливают 50 см3 этилового ректификованного спирта. Через день раствор готов к употреблению.
Для приготовления хинозола 0,1 г порошка растворяют в 100 см3 стерильной дистиллированной воды.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Глубинный метод посева в плотные среды.
Жидкий продукт или разведение навески вносят параллельно в две чашки Петри и заливают не позднее чем через 15 мин расплавленной и охлажденной до температуры (45±1)°С питательной средой. Высота слоя питательной среды должна быть 4—5 мм.
Среду немедленно равномерно перемешивают с посевным материалом круговыми движениями чашки так, чтобы среда не вытекла из чашки н не загрязняла крышку. После застывания среды чашки с посевами вверх дном помещают в термостат.
Поверхностный метод посева на плотные среды.
Среду налипают в чашку Петри и после застывания подсушивают. При подсушивании для удаления влаги с поверхности среды чашки открывают, переворачивают вверх дном и выдерживают в течение 30 мин при 48—50°С или в ламинарном боксе 1—2 ч. или в других условиях, обеспечивающих испарение конденсационной влаги и исключающих микробное загрязнение.
На подсушенную среду наносят жидкий продукт или разведение навески и немедленно равномерно растирают по поверхности шпателем — изогнутой стеклянной палочкой.
Засеянную поверхность подсушивают, выдерживая чашки в горизонтальном положении в течение 15 мин.
Метод посева в жидкие среды.
В колбу или пробирки с питательной средой вносят навеску продукта или разведеные навески.
При определении наиболее вероятного числа (НВЧ) микроорганизмов из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений до такой степени, чтобы можно было определить предполагаемое НВЧ микроорганизмов.
Самое низкое разведение и высеваемые объемы его инокулума выбирают в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов н чувствительности метода следующим образом:
По 1 смЗ из разведения 10-1 и высших разведений, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 1,0 г продукта;
по 10 смЗ из разведения 10-1 или 1 смЗ неразведенного продукта и по 1 смЗ из разведения 10-1 и более высокого разведения, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 10,0 г продукта;
по 10 и 1 смЗ неразведенного продукта и ряда его разведений, если надо определить количество микроорганизмов, превыщающее 3 клетки в 100 смЗ продукта.
Все разведения и неразведенный продукт высевают параллельно в три пробирки с питательной средой. Инокулум объемом 1 смЗ высевают в 10 смЗ среды нормальной концентрации, инокулумы объемом 10 смЗ в 10 смЗ среды двойной концентрации.
Определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.
В стерильную колбу помещают 50 г корма, взятого из среднего образца (взятие корма для навески одноразовое), добавляют 450 мл физиологического раствора (получают разведение 1:10), тщательно встряхивают. Из полученной взвеси готовят последовательные десятикратные разведения (1:100, 1:1000, 1:10000 и т.д.). После оседания взвешенных частиц из верхнего слоя жидкости делают посевы
Для количественного учета микробного обсеменения в стерильные бактериологические чашки вносят по 1 мл каждого разведения и заливают 10-15 мл стерильного, расплавленного и охлажденного до температуры 44-45°С мясопептонного агара. Осторожно покачивая чашки, засеянный материал равномерно распределяют в агаре. После застывания среды чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре 30°С. После 72 часового, термостатирования проводят, подсчет выросших колоний только в чашках, где содержатся не более 300 и не менее 3 колоний. Результаты, полученные при подсчете колоний, умножают на разведения, вычисляют среднее арифметическое. Полученная цифра принимается за общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г корма.
Исследования на сальмонеллы.
Метод последовательного обогащения.
Навеску исследуемого материала 25г помещают в колбу, содержащую 225 мл забуференной пептонной воды (среда предварительного обогащения).
Содержимое колбы тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 37°. Через 6-18 часов производят пересев на основные среды обогащения (селенитовый бульон, магниевую среду или другую аналогичную среду по выбору) в соотношении 1:5.
После 16 - 18 час. инкубирования в термостате при 37° из обогатительных сред бактериологической петлей производят посевы на бактериологические чашки с твердыми дифференциально-диагностическими средами (висмут-сульфитный агар, среда Эндо или другие аналогичные среды по выбору), которые помещают в термостат при 37°.
Засеянные чашки просматривают через 24 - 48 часов.
На висмут-сульфит агаре S. typhi, Sparatyphi А растут в виде мелких, нежных, серовато-зеленых колоний с черным центром; S. choleraesuis - в виде зеленых колоний. Колонии почти всех других сальмонелл значительно крупнее, темно-коричневого цвета с ртутным блеском, окруженные светлым ореолом, участок среды под колонией прокрашен в темно-коричневый цвет.
В случае обнаружения колоний, подозрительных на сальмонеллы, 3-5 из них засевают на МПА (для постановки РА), на бульон Хоттингера (для определения индола и сероводорода), в полужидкий (0,3 - 0,5%) агар (посев уколом для определения подвижности) и трехсахарный агар с мочевиной Крумвиде - Олькеницкого (сначала штрихом на скошенной поверхности, а затем уколом и глубину столбика). Посевы выдерживают в термостате при температуре 37° 16-18 часов. При росте бактерий из рода Salmonella цвет скошенной поверхности среды Крумвиде - Олькеницкого -розовый, столбик - желто-бурый, газообразование устанавливают по наличию трещин и разрыву столбика агара, при наличии сероводорода столбик чернеет.
При разложении лактозы косая поверхность окрашивается в желтый цвет. При разложении одной глюкозы окрашивается только столбик среды и происходит разрыв агара со скоплением в нем пузырьков газа. При разложении мочевины на "скошенном столбике" окраска среды меняется на малиновую.
Культуры, представляющие грамотрицательные, подвижные палочки, ферментирующие глюкозу с образованием газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие мочевину и не образующие индол, подвергаются серологическому исследованию в реакции агглютинации на предметном стекле с набором агглютинирующих сывороток в соответствии с Наставлением к набору. Для реакции агглютинации используют суточные культуры, выращенные на МПА. При этом для реакции агглютинации с О - сыворотками культуру следует брать из верхней части скошенного агара, а для агглютинации с Н - сыворотками - из самой нижней части (конденсационной воды), где микробы наиболее подвижны.
Определение присутствия бактерий группы кишечной палочки
Метод основан на способности бактерий группы кишечной палочки расщеплять маннит, образовывать на средах "ХБ" и Хейфеца кислые продукты, изменяющие цвет индикаторов, входящих в состав этих сред.
По 1 смЗ каждого разведения вносят (по выбору) в пробирки, содержащие по 5 смЗ среды: Эйкмана, Кесслер, Булира, Хейфеца, "ХБ" или КОДА. Посевы помещают в термостат при температуре 43°С для первых пяти сред и 37°С для последней.
Через 24 ч учитывают рост на среде Эйкмана, Булира по помутнению среды и образованию газа, на средах Кесслер, Хей а также на бульон Хоттингера для определения индола и сероводорода). Для определения подвижности культуры производят посев уколом в полужидкий агар (0,3 -0,5%). Титр кишечной палочки устанавливают по наибольшему разведению, в. котором еще наблюдался рост.
Из пробирок, где наблюдается рост микробов, производят посев в количестве 0,1-0,2 смЗ на плотные дифференциально-диагностические среды (Эндо, Левина) и выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 ч.
Типичные колонии Е. coli характеризуются круглой формой, выпуклой или слегка приподнятой в центре поверхностью, ровными краями, розового, красного или малинового цвета с металлическим блеском или без него на среде Эндо и фиолетового или черного - на среде Левина.
Выросшие изолированные колонии (не менее 4) пересевают на мясо - пептонный бульон, выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 ч. После этого одну часть пробирок используют для приготовления мазков, посева на дифференциально-диагностические среды, заражения мышей, вторую - для приготовления кипяченого антигена.