Для приготовления питательных сред можно использовать отход спиртового производства – фильтрат барды. Для этого фильтрат обогащают мукой или заторной массой и добавляют мел для нейтрализации излишней кислотности; фильтрат барды является нестандартным продуктом.
Для приготовления питательных сред может использоваться измельченный картофель или его отвар. Картофель содержит большое количество влаги (до 75%), а основная часть сухого вещества приходится на крахмал. В зависимости от года, сорта и условий выращивания картофеля содержание крахмала может быть от 8 до 27%, в среднем 18-19%. В картофеле азотистых веществ сравнительно мало, не более 2%, клетчатки содержится 1-1,5%; зольные элементы составляют 0,8-1% (К, Nа, Mg, Са, Fe, Si и др.). В малых количествах найдены микроэлементы – марганец, медь, кобальт, никель, йод и т. д. Картофель содержит витамины С,А и целый ряд других веществ в сумме 2,2-2,5%.
Свекловичный жом представляет собой измельченную сахарную свеклу после извлечения из нее сахарозы и некоторых других веществ на диффузионных установках сахарных заводов. Состав жома многокомпонентен, основную его массу составляют безазотистые экстрактивные вещества (66%), в которые входят пектиновые вещества, гемицеллюлозы. В жоме содержится белок (около 8%), клетчатка (22%), зольные элементы (4%).
К числу редко используемых компонентов питательных сред можно отнести казеин и его гидролизат, рыбную муку, рисовые отруби, картофельную мезгу, выжимки плодов, ягод и овощей и т. д.
Для пеногашения используют жиры и масла, которые также могут быть источником питания для микроорганизмов. Чаще всего используют животные жиры, олеиновую кислоту, подсолнечное, соевое, хлопковое, кукурузное масла. Из всех перечисленных пеногасителей рациональнее всего вводить при выращивании олеиновую кислоту, так как остальные масла имеют пищевую ценность и используются в пищевой промышленности. Постепенно они заменяются синтетическими пеногасителями.
При выборе питательной среды для культивирования микроорганизмов необходимо учитывать не только качественный состав среды, но и количественное соотношение ее компонентов. Чрезмерное увеличение концентрации в среде хотя бы одного из них приводит к увеличению осмотического давления и нарушению обмена веществ клетки и угнетению биосинтетической способности клетки и замедлению ее развития и роста. Но в ряде случаев компоненты среды, тормозящие накопление биомассы, могут способствовать активному синтезу клеткой некоторых ферментов.
II.3 Принцип подбора состава сред для поверхностного способа культивирования
При поверхностном культивировании на твердой среде основой почти всех сред являются пшеничные отруби. Среда может быть обогащена некоторыми рыхлителями. В качестве основы среды можно использовать – биошрот, представляющий собой нерастворимый остаток культуры после экстракции ферментов. Но биошрот может быть использован только при обогащении среды крахмалом (картофельная мезга) и ростовыми веществами, вносимыми с солодовыми ростками. При использовании пшеничных отрубей важно установить содержание в них крахмала (должно быть не менее 16-20%). Увеличение содержания крахмала с 6,37 до 23,17 % благоприятно сказывается на биосинтезе всего амилолитического комплекса, особенно а-амилазы, накопление которой в среде возрастает в 2,5 раза. Количество крахмала в отрубях должно быть не менее 16-20%. Помимо пшеничных отрубей при культивировании продуцентов амилаз можно использовать пивную дробину, обогащенную крахмалсодержащей разваренной массой, поступающей из спиртового производства. Варьируя состав среды с учетом физиологических особенностей продуцента и индуцированного характера синтезируемых ферментов, можно получить поверхностную культуру, содержащую желаемый комплекс ферментов.
II.4 Принцип подбора состава сред для глубинного выращивания продуцентов
При составлении питательных сред для глубинного культивирования продуцентов ферментов можно применять малорастворимые компоненты. Но и их количество должно быть ограниченным, так как высокое содержание нерастворимых остатков приводит к ухудшению реологических свойств среды и затрудняет последующую обработку среды и культуральной жидкости. Целесообразнее использовать в составе среды отвары и гидролизаты отходов растительного сырья (отрубей, солодовых ростков, свекловичного жома и т.д), а также грубые фильтраты спиртовой барды, гидролизаты или плазмолизаты микробной биомассы, реже – отдельные аминокислоты. Отсутствие крупной взвеси особенно важно при непрерывном процессе культивирования. Питательные среды готовят на водопроводной воде, содержание сухого вещества в них колеблется от 2,5 до 20% в зависимости от физиологических потребностей продуцента или состава целевого ферментного комплекса; рН питательных сред контролируют в момент приготовления среды, а также после ее стерилизации.
Гидролитические ферменты чаще всего имеют индуцибельную природу, и поэтому в состав среды обязательно включается вещество – индуктор, способствующее наиболее интенсивному накоплению культурой соответствующего фермента.
Источники углерода. Углерод крайне необходим микроорганизмам, так как он определяет основные метаболические пути любого организма. Источниками углерода могут быть самые различные органические соединения, они могут быть использованы в качестве скелетного материала при построении клеточного вещества и в качестве источника энергии.
При получении гидролитических ферментов, обладающих карбогидралазной активностью, источнику углерода придается особое значение, поскольку он почти всегда является стимулятором синтеза соответствующего комплекса ферментов. Если источник углерода (крахмал, пектин и др.) вводится в среду в больших количествах и она становится малоподвижная, то его следует вводить в среду постепенно по мере его потребления микроорганизмом, т. е. дробно.
Индуктором биосинтеза амилаз могут быть мальтоза, изомальтоза, паноза, нигероза, но они используются редко, так как это дорогостоящие вещества. Глюкоза как компонент среды при культивировании продуцентов карбогидраз используется очень редко, поскольку она часто является репрессором синтеза. Крахмал и продукты его гидролиза стимулируют биосинтез ксиланаз и протеиназ.
Пектинсодержащее сырье (отходы переработки плодов и овощей, яблочный и свекловичный пектины, а также гидролизаты этих отходов) являются прекрасными источниками углерода при выращивании продуцентов пектолитических и гемицеллюлазных ферментов. При этом, варьируя составом среды и концентрацией пектинсодержащего сырья, можно достигать определенного соотношения отдельных ферментов пектиназного и гемицеллюлазного комплекса. Благоприятное воздействие на биосинтетическую способность микроорганизмов оказывает лактоза, вводимая в среду в количестве 1,5-3% (введенная в виде молочной сыворотки, стимулирует биосинтез целлюлолитических ферментов, B-галактозидаз любыми продуцентами). Выбор источника углерода зависит от физиологии продуцента и вида образуемого фермента, поэтому оптимальная дозировка источника углерода выбирается индивидуально для каждого микроорганизма.
Источники азота. Источниками азота в питательной среде при глубинном культивировании могут быть минеральные соли и азот органических соединений. В процессе биосинтеза протеиназ источник азота играет роль не только необходимого компонента питания, но и активатора процесса биосинтеза. Наилучший стимулирующий эффект получается при введении в состав среды белков или продуктов их гидролиза. К органическим источникам азота относятся различные животные белки (пептон, казеин, гемоглобин, желатин, яичный альбумин), белки растительного сырья (обезжиренная соя, кукурузный экстракт), биомассы микроорганизмов, а также гидролизаты белков (кислотные, щелочные и ферментативные), отдельные аминокислоты и некоторые другие соединения.
В качестве неорганических источников азота используются различные соли азотной кислоты и аммонийные соли. При выборе источника неорганического азота следует прежде всего обращать внимание на физиологическое воздействие аниона или катиона при избирательном потреблении азота. Изменение рН среды, т. е. ее подщелачивание в случае потребления аниона или подкисление при утилизации катиона может вызвать значительные изменения в биосинтетической деятельности микроорганизма. Не меньшее значение имеет концентрация минерального источника азота (особенно на биосинтез протеиназ). Соли (NH4)2НРО4 при концентрации 0,9% более чем в 5 раз повышают биосинтетическую деятельность бактерий.
По данным многих исследователей, добавление органических источников азота во многих случаях является более эффективным, чем только неорганических, а совместное введение в среду азота солей и органических соединений может привести к их синергическому действию. А дополнительное введение в среду органического азота в виде кукурузного экстракта и пивных дрожжей способствует увеличению биосинтетической активности более чем в 12 раз. Однако единой рекомендации по составлению сред дать невозможно и необходимо экспериментальное определение состава среды для каждого продуцента.
Соотношение углерода и азота в среде имеет большое значение для биосинтеза ферментов, т. е. сбалансированность питательной среды по углероду и азоту. Дефицит одного из этих компонентов в среде не может быть компенсирован избытком другого.
Источники фосфора. Фосфор вносится в среду в виде солей фосфорной кислоты, реже – в виде органических соединений, например фитина. Фосфор может быть введен в среду с различными естественными субстратами: отварами растительных тканей, мукой, кукурузным экстрактом и т. д. Фосфор является очень важным элементом питательной среды; он входит в состав АТФ, АДФ, АМФ, которые обеспечивают энергетический обмен в клетке, а также осуществление главнейших биосинтетических процессов (синтез белков, нуклеиновых кислот, гликолиз и другие биохимические превращения). Фосфор интенсивно потребляется из среды в логарифмической фазе роста культуры, что соответствует наиболее интенсивному течению биосинтетических процессов и образованию клеточного вещества. Обычно в этот период роста в биомассу из среды переходит до 83-91% фосфора. Потребность культуры в фосфоре можно приблизительно определить путем анализа золы микробной массы продуцента.