Для промивання посуду та інструментів після стерилізації їх кип’ятінням, видалення залишків спирту з шприців-катетерів, зволоження піхвових дзеркал перед введенням у піхву, готували 0,9%-й розчин натрію хлориду. Для цього у чисту хімічну колбу наливали 100 мл дистильованої води, відважували і вносили в колбу 0.9 г хімічно чистого натрію хлориду і розмішували стерильною скляною паличкою. Доводили розчин до кипіння, охолоджували та зливали в стерильні баночки, які потім закривали притертими кришками. Такий розчин готували щодня.
Приготування 2,9%-го розчину натрію цитрату. У чисту стерильну колбу наливали 100 мл прокип’яченої і охолодженої дистильованої води, потім відважували 2,9 г хімічно чистого тризаміщеного п’ятиводневого натрію цитрату, висипали у колбу та ретельно розмішували стерильною скляною паличкою. Після цього, фільтрували крізь паперовий фільтр у стерильну колбу, закривали нещільно ватно-марлевим тампоном і кип’ятили протягом 10 хвилин. Розчин готували щодня. Натрію цитрат має слабко лужну реакцію і буферні властивості, він нетоксичний для сперміїв, нейтралізує молочну кислоту, яка нагромаджується у спермі. Використовували його при оцінці якості сперми та розморожуванні замороженої сперми.
Приготування розчину соди. Відважували 15 г кальцинованої соди і розчиняли в 1 л гарячої води. Використовували розчин для миття посуду, піхвових дзеркал, різних інструментів та ін.
Приготування 70%-го спирту. В умовах виробництва ми готували його з 96%-го спирту-ректіфікату. Спочатку наливали у 500-мілілітровий циліндр спирт-ректифікат, обережно занурювали у нього спиртометр і по верхньому меніску перевіряли його міцність. За нижче наведеною формулою ми визначали скільки такого спирту треба взяти для одержання 100 мл 70-го.
Х = (70 × 100) : М,
де: Х – кількість спирту-ректіфікату, мл; М – міцність срирту-ректіфікату, град;
Якщо спирт 96%-ний, то Х=(70×100) : 96 = 72,9 мл.
З розрахунку виходить, що для приготування розчину треба узяти приблизно 73 мл. До 73 мл 96%-го розчину ми доливали 27 мл прокип’яченої дистильованої води. Міцність розведеного водою спирту перевіряли спиртометром. 70%-й спирт використовували для знезараження шприців-катетерів, мікро шприців, баночок та інших предметів. Такий розчин викликає слабшу коагуляцію білка, ніж 96%-й спирт, тому глибше проникає в протоплазму клітин і швидше спричиняє їх смерть.
Приготування розчину 0,02%-го фурациліну та 0,01-го фуразолідону.
Ці розчини ми готували на 0,9%-му розчині натрію хлориду. (табл. 2)
Таблиця 2 – Приготування розчину 0,02%-го фурациліну та 0,01-го фуразолідону
| Порошок | Таблетки | ||
| на 5 л | на 1 л | 0,02 | 0,1 |
| Фурацилін 1 г | Фурацилін 0,2 г | Фурацилін 1 таб. | Фурацилін 1 таб. |
| Хлорид натрію 50 г | Хлорид натрію 10 г | - | Хлорид натрію 5 г |
| Вода 5 л | Вода 1 л | Вода 100 мл | Вода 500 мл |
Використовували ці розчини для санітарної обробки зовнішніх статевих органів корів перед осіменінням, знезараження поверхні робочого столу, спецвзуття і фіксаційного станка.
Для штучного осіменіння використовували глибоко заморожену сперму, яка зберігається у судинах Дьюара при температурі -196ºС.
Перед використанням спочатку переносили дозу сперми в флакон з 1 мл 2,9%-ним розчином цитрату натрію для її відтаювання.
Потім, під мікроскопом при температурі 38-40º С перевіряли якість сперми і допускали до штучного осіменіння сперму з таким показниками: - активність сперми - не нижче 4-х балів; - кількість сперміїв (з прямолінійним поступальним рухом) у дозі не менше 15 млн.; - живучість сперміїв у водяному термостаті при температурі 38±0,5ºС не менше 5 годин.
Оцінку якості сперми в облицьованих гранулах проводили без її розгерметизації, через прозору плівкову оболонку за допомогою спеціального пристрою.
При застосуванні мано-цервікального способу осіменіння використовували стерильний поліетиленовий катетер, довжиною 7,5 см, ампулу і полімерну рукавицю, а в разі використання сперми в облицьованих гранулах застосовували спеціальний інструмент - зоопшриц, який складається із циліндра з фланцем та поршня. Всі ці інструменти призначені для одноразового використання і загерметизовані в плівкову індивідуальну упаковку.
Техніку осіменіння за цим способом виконували в такій послідовності. Брали стерильну ампулу, стерильними ножицями зрізували її конус і з'єднували зі стерильним катетером. Потім набирали сперму об'ємом 1 мл і розміщали на стерильній підставці. Облицьовану гранулу після розморожування знезаражували спиртовим тампоном, протираючи її поверхню. Потім вміщували її у циліндр зоошприца і поршнем досилали до переднього краю. Стерильною голкою проколювали оболонку гранули крізь вихідний отвір інструменту. Перед осіменінням проводили вологу санітарну обробку зовнішніх статевих органів корови, надівали стерильну поліетиленову рукавицю, змочували її ізотонічним розчином натрію цитрату і обережно вводили руку у піхву корови. Протягом хвилини проводили масаж шийки матки. Другою рукою подавали підготовлений до осіменіння інструмент, масажуючи шийку матки проштовхували катетер в її канал на глибину 8 см і, піднявши ампулу (зоошприц) видавлювали сперму в шийку матки. Після введення сперми виймали руку із піхви, рукавицю і інструменти утилізували і додатково проводили масаж клітору.
При ректо-цервікальному осіменінні із використанням заморожено-відтаненої сперми у формі не облицьованих гранул брали пакет з ампулами, кут якого знезаражували спиртово-ватним тампоном, надрізали і виймали ампулу, знезараженими ножицями зрізували конус шийки ампули. Таким же чином брали пакет з довгими катетерами, надрізали стерильними ножицями упаковку і виштовхували через отвір кінець катетера не більш ніж на 2 см, після цього герметично з'єднували катетер з ампулою і набирали розморожену сперму в катетер.
На праву руку одягали довгу одноразову рукавицю. Після санітарної обробки корови великим і вказівним пальцями розкривали статеву щелину і катетер вводили знизу вверх під кутом 30-45° по верхній стінці піхви приблизно до половини його довжини. Потім переводили інструмент в горизонтальне положення і проштовхували його до шийки матки. Після цього руку захищену рукавицею вводили в пряму кишку. Рукавицю перед введенням зволожували мильною водою. Спочатку відшукували яєчник і діагностували його на наявність дозрілого фолікула. Після цього фіксували шийку матки рукою, відшукували піхвову частину каналу шийки матки і вводили катетер під контролем пальців у канал шийки. При цьому направляли шийку матки на катетер таким чином, щоб останній пройшов весь канал. Після цього ампулу здавлювали і сперма через катетер вводилася в матку. Не відпускаючи ампули, катетер виймали із піхви, а руку - з прямої кішки. Одноразові інструменти після використання знищували.
При використанні сперми розфасованої в облицьованих гранулах, після їх розморожування, спермодозу виймали із біотермостату, витирали їх поверхню стерильною серветкою від залишків води і знезаражували 96° спиртом. Підготовлену таким чином спермодозу вставляли в наконечник зоопшрица і під'єднували до нього спеціальний подовжувач, який складається з металевого трубчатого корпуса і дротяного стержня з дисковим упором. На корпусі є замок для фіксації одноразового чохла, який надівають на зібраний інструмент. Перед введенням наконечника в канал шийки матки інструмент розчохлювали шляхом подання чохла за допомогою замка в протилежний бік в напряму зовнішніх статевих органів. При цьому забезпечується введення стерильного наконечника асептичним способом.
Для визначення впливу стрес-факторів на склад крові використовували метод визначення кількості еозинофілів в крові тварин. При цьому досліджували тварин, яких осіменяли в стійлах і у пункті штучного осіменіння.
У своїх дослідженнях користувалися методом С.М. Бакмана. Кров узяту від корів змішували з спеціальною рідиною, яка руйнує еритроцити і усі інші форми лейкоцитів, окрім еозинофілів. В такій рідині еозинофіли набувають червоного або яскраво-оранжевого кольору. Для фарбування еозинофілів використовували рідину, яка має такий склад: еозин калію – 0,5 г, формалін концентрований (40%) – 0,5г, фенол концентрований (88 – 95%) – 0,5г, вода дистильована – до 100 мл.
Хід аналізу. В чисті і сухі пробірки об’ємом 3 – 4 мл наливали по 0,4 мл рідини і закривали гумовими пробками. Пробірки нумерували згідно пробам крові. Потім 0,02 мл цільної крові доливали в пробірки з рідиною і активно перемішували. Для взяття проб крові використовували піпетки від гемометра Салі, які відградуйовані точно по 0,02 мл, при цьому кров розчиняється в 21 раз. Пробірки ставили в штатив і витримували 1 годину.
Підрахунок еозинофілів проводили в лічильній камері Горяєва через 3 години після початку фарбування.
Камера має дві сітки, кожна з яких у свою чергу має по 225 великих квадратів. Підрахунок еозинофілів ми проводили по усій сітці, не звертаючи увагу на лінії, якими розділені квадрати один від одного.
Камера Горяєва має глибину 0,1 мм і площину сітки 9 мм². Об’єм однієї половини камери дорівнює 0,9 мм³. Для визначення кількості еозинофілів в 1 мм³ крові ми підраховану кількість клітин по усій сітці помножували на 21( ступінь розчинення крові рідиною) і ділили на 0,9(об’єм камери).
Одним із найбільш вагомих науково-практичних досягнень минулого століття є винайдення, розробка та широке впровадження у виробництво довготривалого зберігання сперми та нового біотехнологічного методу відтворення – штучного осіменіння. Дані розробки дали можливість ефективно використовувати біологічний потенціал кращих самців-плідників, полегшили оцінку нащадків, покращили швидкість та ефективність генетичної селекції, дозволили координувати племінну справу в країні, зменшили ризик поширення заразних хвороб, які передаються статевим шляхом [2].