Про различные варианты использования ПЦР, для идентификации полиморфизма можно говорить неделями, а уже 6, через два часа мне надо идти гулять с собакой и ехать в университет, а ещё хочется про гибридизацию рассказать и итоги подвести. Да и в общем-то принципиальных различий в множестве методов амплификации нет, такое огромное количество методов обусловлено невероятной сложностью устройства генома. Как небольшой итог хочу обратить ваше внимание на наличие двух основных принципов использования ПЦР, в одном случае мы не знаем последовательность исследуемого гена и проводим аналогию между сцеплением «аллелей амплификации» и аллельным положением исследуемого гена (или какой-либо иной последовательности), а в другом случае мы знаем сиквенс нашей последовательности (в частности гена) и работаем с ним непосредственно.
Необходимо обратить внимание на то, что методы полиморфизма ДНК позволяют рассуждать не только о наличии или аллельности экспрессирующих последовательностей, но и о генах-регуляторах, и о неэкспрессрующих последовательностях, а также устанавливать гомо- или гетерозиготность организма и ещё кучу всего интересного[5].
А теперь поговорим немного о гибридизации. Гибридизация, в данном случае, это образование водородных связей между комплементарными нуклеотидами двух одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот (ДНК-ДНК; ДНК-РНК; РНК-РНК). Этот метод может использоваться для картирования генома (FISH), определения гомологии геномов различных организмов (GISH), для идентификации генетических маркеров и многого другого. Чтобы использовать гибридизацию в качестве молекулярного маркера нам необходимо изготовить зонд (ну или купить его). Зондом называют известную нам одноцепочечную последовательность ДНК либо РНК, комплементарную искомой нами последовательности (например, гену), обладающую какой-либо меткой. Зонд может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов. В качестве метки можно использовать флюрохромы или радиоактивные нуклеотиды. Кстати говоря, часто ДНК-зонды получают при помощи ПЦР в присутствии меченых нуклеотидов или ещё рядом методов.
Один из вариантов гибридизации – блоттинг. Например, Саузерн-блоттинг (Southern-blotting, Southern-transfer) – это метод обнаружения специфических нуклеотидных последовательностей путем переноса, электрофоретически разделенных, фрагментов ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр за счет капиллярного эффекта (blotting – «промокание») и гибридизации ДНК- или РНК-зондом, комплементарным искомой последовательности; образование гибридов обнаруживают в основном методом авторадиографии. Метод разработан Э.Саузерном и Р.Дэйвисом в 1975. Если изучаемую геномную ДНК гидролизовать какими-либо рестриктазами, разогнать полученную смесь фрагментов на электрофорезе, перенести фрагменты на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизовать их с ДНК-зондом исследуемой последовательности, можно убить сразу двух зайцев: выявить имеется ли определяемая последовательность у исследуемого существа и, если имеется, то в каком из рестрикционных фрагментов она находиться. Подобный метод работы с РНК называется Нозерн-блоттинг, а с белками Вестерн-блоттинг. При помощи Нозерн-блоттинга можно выявить экспрессируется или молчит какой-либо ген в исследуемой клетке, для этого надо провести гибридизацию соответствующего ДНК-зонда с молекулами РНК, выделенными из клетки. При помощи блоттинга возможно идентифицировать и различные аллельные варианты генов, для этого необходимо изготавливать минисателитные ДНК-зонды (длиной 15-20 нуклеотидов), комплементарные участку точечной мутации на молекуле ДНК[6].
Методы гибридизации с использованием ДНК-зондов очень хороши и несложны. Они дают точную информацию о интересующем нас объекте, но имеет и недостатки, например необходимость знать точную последовательность нуклеотидов в исследуемом фрагменте ДНК либо РНК. В настоящее время разработан метод анализа с использованием чипов. Чипы представляют собой пластинки с иммобилизованными ДНК-зондами. Каждая такая пластинка может содержать несколько десятков тысяч зондов, расположенных в определенной последовательности. Метка проявляется только в спаренных двухцепочечных фрагментах. Если в исследуемом образце есть последовательности, комплементарные последовательностям зонда, то гибридизацию можно определить визуально или с помощью специальных приборов. Как правило, детекторы соединены с компьютером, то есть процедура считывания, и обработки информации автоматизирована.
Такие ДНК-чипы можно применять для комплексной диагностики инфекционных заболеваний, наследственных дефектов, установления экспрессии тех или иных генов (в этом случае идет гибридизация с мРНК), то есть отслеживания нарушений обмена веществ. Они дешевы, очень надежны, просты в обращении и могут многократно использоваться. Недостаток – дорогая аппаратура для детекции.
Вернёмся к нашим козам и посмотрим, какой же метод использовали для детекции наши чабаны:
А пользоваться они стали самым распространённым и универсальным – ПЦР диагностикой. Серхио в интернете нашёл библиотеку генетических маркеров коз, сделанную каким-то исследователем до них, Ванька проанализировал какие гены им нужны, а Джамбулат праймеры нужные на всех заказал (наверное ему сын помог). И начали они коз своих оценивать при помощи маркеров. Отобрали каждый нужных коз и Ваньке привезли, начал он их скрещивать. После каждого скрещивания всё потомство снова при помощи маркеров оценивалось и так пока абсолютной однородности по исследуемым признакам не добились. Получили наши чабаны новую породу, жирномолочную, густошерстную, равнинную. Стали жить-поживать и добра наживать!
Заключение
Селекция при помощи маркеров это новая, развивающаяся наука. В настоящее время она получает распространение на все виды сельскохозяйственных животных и растений. MAS уже используют в селекции свиней, лошадей, КРС, овец и других животных. В настоящее время вклад MAS в общую селекцию не велик, но будущее именно за маркерами. Проблема продовольствия во всём мире уже даёт о себе знать и это только начало. Экстенсивное развитие сельского хозяйства приводит к глобальному уничтожению природы, а еды всё равно начинает не хватать. Применение новых методов селекции позволит, со временем, перейти на интенсивное хозяйство, получить растения и животных гораздо большей продуктивность и более устойчивых к различным факторам среды. Если действовать с умом, то в будущем перестанут уничтожать природу, бешеный рост населения земли прекратиться, уровень населения стабилизируется, с, сравнительно, небольших территорий можно будет получать необходимое количество продуктов питания и сырья для промышленности. Есть небольшая надежда, что человек наконец заживёт в гармонии с природой.
Как я уже говорил, MAS безопасна с точки зрения экологии и потребления продуктов питания. Это один из реальных, с моей точки зрения, путей спасения планеты.
Будущее за селекцией при помощи маркеров!
В своей работе я постарался своим языком объяснить своё собственное понимание применения селекции при помощи маркеров. Механизмы адаптации и мутирование генов, которые я приводил в работе, придуманы мной, но я старался максимально приблизиться к реальным эволюционным механизмам. Все личности и названия генов, исключая учёных и фосфофруктокиназу-1, являются также вымышленными, любые аналогии проведённые с реальными людьми будут являться чистым совпадением.
Список использованной литературы:
1. П.Н. Харченко, В.И. Глазко. ДНК-технологии в развитии агробиологии. М: «Воскресенье», 2006, — 480 стр. с илл.
2. Деева B.C., Сухова Н.О. Группы крови крупного рогатого скота и их селекционное значение / РАСХН. Сиб. отд-ние. Сиб-НИПТИЖ. — Новосибирск, 2002. — 172 с.
3. Л.А. Калашникова, И.М. Дунин, В.И. Глазко Селекция XXI века: использование ДНК-технологий / Минсельхоз РФ. ВНИИПлем. -- Московская область, Лесные Поляны, 2001 – 50 с.
4. www.elbib.ru/index.phtml?page=elbib/rus/journal/1999/part3/orlova - 36k -
5. www.biotechnolog.ru/ge/ge7_1.htm - 10k
[1] П.Н. Харченко, В.И. Глазко. ДНК-технологии в развитии агробиологии. М: «Воскресенье», 2006, — 480 стр. с илл. стр. 55-56.
[2] Деева B.C., Сухова Н.О. Группы крови крупного рогатого скота и их селекционное значение / РАСХН. Сиб. отд-ние. Сиб-НИПТИЖ. — Новосибирск, 2002. — 172 с. стр. 133-150.
[3] Л.А. Калашникова, И.М. Дунин, В.И. Глазко Селекция XXI века: использование ДНК-технологий / Минсельхоз РФ. ВНИИПлем. -- Московская область, Лесные Поляны, 2001 – 50 с. стр. 5-15.
[4] www.elbib.ru/index.phtml?page=elbib/rus/journal/1999/part3/orlova - 36k -
[5] П.Н. Харченко, В.И. Глазко. ДНК-технологии в развитии агробиологии. М: «Воскресенье», 2006, — 480 стр. с илл. стр. 101-108.
1. [6] www.biotechnolog.ru/ge/ge7_1.htm - 10k