В Московском НИИ педиатрии и детской хирургии разработана справочно-диагностическая система “ДИАГЕН” – диагностика генетических болезней. В память мшины введены признаки около 1400 синдромов и болезней моногенной и хромосомной природы. Система ориентирована на выделение узкого дифференциально-диагностического ряда и отдельных заболеваний. В ней предусмотрена возможность расширения и дополнения перечня болезней. В последней версии она включает не только описания, но типичные фотографии больных, демонстрируемые на дисплее персонального компьютера.
§7. Генная терапия.
Не подлежит сомнению, что радикальным методом лечения наследственных моногенных болезней должна стать генная терапия, однако, лишь в самые последние годы появились реальные предпосылки для ее практического применения. Значительно раньше появились эффективные методы консервативной терапии – они не изменяют генотип, но направлены на коррекцию метаболических или иммунологических дефектов, возникающих под влиянием мутантных генов. При раннем распознавании болезни с помощью этих методов удается моделирование нормального фенотипа путем целенаправленной диетотерапии, введения витаминов, гормонов, недостающих белков, микроэлементов.
Генная терапия – это метод введения фрагмента ДНК в клетки больного человека с целью замещения функции мутантного гена и лечения наследственных болезней.
Еще в конце 60-х годов выяснилось, что клетки животных и человека способны поглощать экзогенную ДНК, встраивать ее в свой геном, после чего проявляются экспрессия введенных генов, в частности, в виде синтеза отсутствовавших ранее белков и ферментов. Были разработаны методы доставки ДНК в клетки с помощью вирусов и других носителей.
Впервые попытка генной терапии в клинике была предпринята М.Клайном в 1983 году., когда им было осуществлено введения нормального бета-глобинового гена больным бета-талассемией. Позднее была разработана методика генной терапии наследственной недостаточности аденозин-деаминазы (тяжелый иммунодефицит): нормальный ген был введен в клетки костного мозга больного и после их ретрансплантации восстановилась активность фермента, состояние больного улучшилось. Проведены клинические эксперименты по генотерапии рака. В лейкоциты больных злокачественной меланомой и поздними стадиями рака были введены гены, маркирующие злокачественные клетки (чтобы их могла узнавать имунная система). У половины больных размеры опухолей уменьшились в два раза и более.
В настоящее время насчитывается более 40 заболеваний, при которых испытывается генная терапия – от редких форм (недостаточность аденозин-деманиазы) до распространенных, таких как рак, болезни сердечно-сосудистой системы и иммунодефициты. Весьма важно, что фрагменты ДНК и соответствующие гены были введены в клетки-мишени, которые были бы способны к последующему делению (клетки печени, стволовые клетки костного мозга и т.п.).
Самая сложная проблема – перенос фрагмента ДНК (гена) в клетку. В большинстве случаев для этих целей используются генетически модифицированные вирусы или вирусные векторы, и чаще всего мышиные ретровирусы. Они способны инфицировать любую и вместе с желаемым фрагментом ДНК легко включаются в геном клетки-хозяина ДНК для того, чтобы превратить ретровирусы-векторы, из них с помощью генно-инженерных методов удаляются нуклеотиды, ответственные за их размножение, однако введенный с вирусом-вектором ген передается дочерним клеткам при клеточном делении. Однако, эти векторы не годятся для введения ДНК-фрагментов в неделящиеся клетки человека, например, в нейроны. Они мало пригодны для переноса генов в клетки, отличающиеся низкой митотической активностью в клетки эпителия дыхательных путей. Эти обстоятельства обусловили поиск других вирусных векторов, среди которых внимание привлекли аденовирусы. Из них также удаляются нуклеотиды, ответственные за репликацию. Аденовирусы могут переносить ДНК в неделящиеся клетки, чем отличаются от ретровирусов. Но в этом случае переносимая аденовирусом ДНК не встраивается в геном клетки хозяина, она остается вне хромосом, хотя и проявляет генную активность. В силу эписомальной локализации она не передается дочерним клеткам. Но с другой стороны, аденовирусные векторы позволяют вводить гены в клетки нервной системы, аденовирусные векторы позволяют вводить гены в клетки нервной системы и эпителий дыхательных путей.
В качестве вектора генов используется также вирус простого герпеса - тип 1. Этот вектор легко встраивает экзогенную ДНК в нейроны, клетки печени. Как и другие вирусы-векторы, герпес-вирус подвергается генно-инженерной обработке, ведущей у утрате его способности к размножению (деления части вирусной ДНК). Испытываются в качестве векторов ДНК парвовирусы.
Наряду с биологическими применяют физико-химические методы введения экзогенной ДНК в клетки хозяина. Для таких целей используется конъюганты ДНК с трансферрином или асиалогликопротеином, для которых на многих клетках имеются рецепторы (лиганд-рецепторный принцип). После связывания с рецептором конъюганты ДНК поглощаются клеткой, хотя вероятность встраивания введенной ДНК в геном хозяина очень невелика. Все же такой ген может временно выполнять свои функции.
Разработана технология микроинъекций ДНК в клетки (миоциты), а также введение генов с помощью липосом.
Методы генной терапии постепенно входят в арсенал современных эффективных методов лечения наследственных заболеванийчеловека, что особенно важно в тех случаях, когда других возможностей просто не существует.
Семейная гиперхолестеринемия – еще одно заболевание – кандидат для генной терапии. Как известно, это заболевание представляет высокий риск для жизни молодых людей, т.к. отличается ранним инфарктом миокарда и ранним атеросклерозом. Оно связано с отсутствием на мембранах клеток рецепторов для липопротеинов низкой плотности, что обуславливает очень высокий уровень холестерина в крови. Так как рецепторы отсутствуют на клетках печени, то пока для введения генов прибегают к частичной гепатоэктомии. С помощью ретровирусного вектора в клетки печени вводится ген рецептора липопротеинов низкой плотности, после чего гепатоциты инъецируются в полую вену. В результате содержание холестерина в крови снижается на 35-50%. Конечно, пока данная технология слишком сложна, чтобы получить широкое практическое применение.
Наследственный дефицит гормона роста, проявляющийся выраженной низкорослостью также может быть устранен с помощью генной терапии. Ген гормона роста удалось ввести в миоциты, которые начинали продуцировать этот гормон. В ближайшее время будут проведены клинические испытания данного метода.
Ведутся интенсивные разработки методов генной терапии рака. Одна из возможностей состоит в том, чтобы ввести в опухолевые клетки гены, продуцирующие такие белки, которые позволяют иммунной системе организма распознавать и уничтожать эти клетки (например, ген интерферона). Другой путь заключается во введении в опухолевые клетки вирусных генов, которые позволяют использовать с лечебными целями противовирусные препараты (например, ганцикловир при введении гена тимидиин-киназы вируса герпеса). Еще один путь – введение в клетки антионкогенов (генов-супрессоров опухолевого роста). Однако, все эти методы пока находятся на стадии доклинических испытаний.
Ген муковисцидоза был введен трем больным в дыхательные пути с помощью аденовирусного вектора, за больными ведется наблюдение.
Уже в ближайшем будущем генная терапия займет ведущее место в лечении многих болезней, считавшихся ранее неизлечимыми.
Методы трансплантации тканей также могут быть отнесены к категории генной терапии, в частности, трансплантация костного мозга. Гены вводимых стволовых клеток могут активизировать дифференцировку многих клеточных линий – лимфоцитов, моноцитов, полинуклеаров, этитробластов. Это позволяет применять данный метод при лечении некоторых первичных иммунодефицитов гемоглобинопатий, болезни Гоше.
Пересадка гепатоцитов открывает другую возможность лечения фенилкетонурии, гиперхолестеринемии, нодостаточности альфа-I-антитрипсина. Пересадка клеток островкового аппарата поджелудочной железы предложена для лечения ювенильной формы сахарного диабета.
Сочетание возможностей генетики и клинической педиатрии позволит уже в недалеком будущем решать сложнейшие вопросы лечения и профилактики наследственных моногенных болезней. Современная медицинская и клиническая генетика представляет собой ярчайших пример единения науки и практики. Исследования, еще недавно представляющиеся сугубо теоретическими, в считанные годы получают реальный практический выход на благо здоровья настоящего и будущих поколений.
§8. Методы исследования наследственности человека.
Основные генетические законы и закономерности имеют универсальное значение и в полной мере приложимы к человеку. Человек как объект генетических исследований имеет ряд особенностей. Как у объекта исследования у него есть свои достоинства и свои трудности. Трудности: большое число хромосом в кариотипе человека; продолжительность цикла развития до наступления половозрелости, человека – одноплодная особь (за одну беременность как правило рождается один ребенок), исключение – рождение близнецов; малое количество детей в браке (обычно, один ребенок); невозможно формировать необходимую схему брака, так как люди свободно скрещиваются (в основе браков лежат любые мотивы, кроме научно-исследовательских целей).
Однако исчерпывающие знания по анатомии и физиологии человека (т.к. начиная со времен Галена и Гарвея по настоящее время велись эти исследования), большое число мутаций, пополняемых и в настоящее время, многочисленность человеческой популяции в целом позволяют всегда выбрать нужную схему брака.