Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 робіт, з яких: 5 наукових статей у спеціалізованих фахових виданнях, 3 тези доповідей на наукових конференціях.
Обсяг і структура дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 124 сторінках друкованого тексту, з яких 110 сторінок складає основний зміст.д.исертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків і переліку використаної літератури (148 першоджерел, розміщено на 14 сторінках). Робота ілюстрована 12 таблицями, 42 малюнками, з них 37 - мікрофотографії.
Матеріали й методи дослідження.
Матеріалом дослідження були 28 кролів самців породи "шиншила", вагою 3500 - 4200 г., віком 12 місяців. Тварини перебували на холестериновій дієті (Аничков Н.Н., 1913) протягом 180 діб. Експериментальних тварин розподілили на групи: І – контроль (5 тварин), ІІ - модель атеросклерозу (23 тварини) які утримували в стандартних умовах віварію. Після досягнення піка моделі (6 місяців годування холестерином) 23 тварини ІІ групи були розділені на підгрупи: 1 - спонтанний регрес експериментального атеросклерозу (10 тварин); 2 - введення АКП на тлі регресу спонтанного атеросклерозу (10 тварин); 3 - пік моделі (3 тварини).
В експерименті використовували протягом 6 місяців холестерин виробництва С. – Петербург, Росія, у дозі 200 мг/кг маси тіла per os за схемою: 5 днів - годування холестерином, 2 дні – відпочинок.
Після припинення навантаження холестерином спонтанний регрес, а також ефекти введення АКП на тлі регресу атеросклерозу, досліджували протягом 6 тижнів. На 6-му місяці експерименту тваринам2-їпідгрупи введено АКП.
Плаценту для подальшого використання одержували у двох безпородних кролиць при доношеній вагітності після 4 тижнів гестації.
Для кріоконсервування із плацентарної тканини вирізали фрагменти розміром 0,8х0,8 см., вагою 550-600 мг. Перед проведенням циклу кріоконсервування фрагменти занурювали в 10% розчин ДМСО на 20 хвилин,далі їх переносили в поліамідний контейнер і заморожувализа 2-етапною програмою відповідно до методичних рекомендацій (Грищенко В.І., Прокопюк О.С., 1999). Відігрівання зразків здійснювали на водяній бані при температурі 40°С.
На попередньо обробленій ділянці спини під інфільтраційною анестезією 0,5% розчину новокаїну робили розріз довжиною 3 см. та формували підшкірнийкарман,в який поміщалифрагменти плаценти. На шкіру накладали 2 шви та обробляли розчином брильянтового зеленого.
Через 6 тижнів після введення АКП, тварин 1-3 підгруп піддавали евтаназії відповідно до документів: Директиви 86/609 ЕЕС і угодою Ради Європи ЕТ 123. Всі експерименти проводили згідноз "Загальними етичними принципами експериментів над тваринами", схваленими Першим національним конгресом з біоетики (20 вересня 2001 р. Київ, Україна) та "Правилами використання лабораторних експериментальних тварин" (1984, додаток 4).
Для проведення планіметричного, гістологічного, гістохімічного та цитологічного досліджень були виділені аорти, фрагменти аорти, шматочки міокарду та приготовлені цитологічні препарати крові експериментальних тварин.
Біохімічні методи контролю за станом ліпідного обміну та рівнем естрадіолу в сироватці крові експериментальних тварин. Для контролю за розвитком моделі атеросклерозу показники ліпідного обміну досліджували через кожні 30 діб протягом 6 місяців у І та ІІ групах. Визначали показники рівня ЗХС, тригліцеридів (ТГ) і ХС ліпопротеїдів високої щільності (ЛПВЩ). Для дослідження використовуали реактиви фірми "Lachema": для визначення рівня ЗХС - CHOL 150, бета-ліпопротеїнів - BLP 200, і ТГ - TG 50. Рівень ЛПНЩ і ліпопротеїдів дуже низької щільності (ЛПДНЩ) визначали за формулами:
ЛПНЩ = ЗХС - (ЛПВЩ + (ТГ/2,18));
ЛПДНЩ = ТГ/2,18.
Коефіцієнт атерогенности (КА) визначали за формулою:
КА = (ЗХС - ЛПВЩ) / ЛПВЩ (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1999).
Показники ліпідного обміну на піку розвитку експериментального атеросклерозу при його регресі, а також після введення АКП на тлі регресу реєстрували щотижня протягом 3-х тижнів.
Рівень естрадіолу у сироватці крові тварин досліджували прямим твердофазним імуноферментним методом з використанням реактивів фірми DRG (EstradiolElisaKit). Показники рівню естрадіолу в сироватці крові визначали у тварин всіх груп та підгруп.
Статистична обробка отриманих результатів проводилася за допомогою програми Statgraph 2.0
Планіметрична оцінка частоти й поширеності осередків ліпоїдозу в інтимі аорти. Аорти виділяли від дуги до біфуркації на стегнові артерії, фіксували в нейтральному 10% розчині формаліну, після чого для проведення планіметрії забарвлювализа методом(Непряхин Г.Г., 1979). Площу осередків ліпоїдозу визначали за допомогою морфометричної програми Bіovіsіon 3.0. Фотозйомку аорт проводили цифровим фотоапаратом Olympus C 180.
Морфологічні та гістохімічні методи дослідження морфофункціонального стану міокарду, ендотелію аорти та лейкоцитів периферічної крові. Для гістохімічного дослідження шматочки аорти та міокарду заливали в парафін, гістологічні зрізи тканин забарлювали гематоксилін-еозином, пікрофуксином за методами: Ван-Гізон, Харта і Вейгерта (Пирс Э., 1962, Лилли Р., 1969).
Для морфологічного дослідження ендотелію шматочки аорти піддавали перфузії розчином глюкозо-формаліну, імпрегнували азотнокислим сріблом, проявляли в стандартному фотопроявнику й дофіксовували в 10% розчині формаліну протягом 12 годин (Кондаков І.К., 2000). Імпрегновані сріблом препарати аорти досліджували методами світлової, растрової й трансмісійної електронної мікроскопії. Враховували площу ендотеліоцитів і кількість міжендотеліальних дефектів з розрахунку на 100 клітин. Площу ендотеліоцитів визначали за допомогою морфометричної програми Bіovіsіon 3.0.
Для вивчення популяційного складу лейкоцитів крові кролів і визначення кількості «ліпіднавантажених» лейкоцитів кров забирали щотижня, готували цитологічні препарати: мазки крові висушували на повітрі, фіксували в парах формаліну і забарвлювали азур-еозином (за методом Романовського), а також суданом чорним Б (за методом Ліллі-Бартнера (Лилли Р., 1969)). Популяційний склад лейкоцитів крові кролів вивчали за допомогою класифікатора (Никитин В.Н., 1949). Розподіл лейкоцитів на популяції проводили, враховуючи площу оптичного перетину лейкоцитів таїх морфологічні особливості. «Ліпіднавантажені» лейкоцитипідраховували в 50 полях зору на кожному мазку, при збільшенні 400. Площу оптичного перетину досліджуваних лейкоцитів визначали за допомогою морфометричної програми Bіovіsіon 3.0., фотореєстрацію проводили цифровим фотоапаратом Olympus C 180.
Електронно-мікроскопічні методи оцінки стану аорти кролів. Фіксовані в 2,5% розчині глютарового альдегіду шматочки артерій використовували для електронно-мікроскопічного вивчення ультраструктурних особливостей люмінальної поверхні судин методом скануючої електронної мікроскопії (СЕМ). Шматочки тканини аорти розміром 0,4х0,4 смзневоднювали в батареї спиртів висхідної концентрації і напиляли у вакуумі сріблом, золото-паладієм і досліджували в СЕМ РЕМА-202 (м. Суми). Для вивчення особливостей мікроархітектоніки внутрішньої еластичної мембрани (ВЕМ) аорти шматочки судин піддавали лужній дисоціації за методикою (SongS. H., 1983, 1984), промивали у фосфатно-сольовому буфері (ФСБ) і підготовляли до дослідження в СЕМ за наведеною методикою. Для дослідження в трансмісійному електронному мікроскопі (ТЕМ) зразки тканин дофіксовували в 1% розчині чотирьохосмію, відмивали у ФСБ, зневоднювали в спирті, ацетоні й заливали в епон-аралдіт (Fluka, Швейцарія). Ультратонкі зрізи контрастували уранілацетатом, цитратом свинцю й досліджували в ТЭМ JEOL-100.
Отримані результати обробляли статистистичним методом Вілкоксона-Уітні-Манна та каноничної корреляції за допомогою пакету компютерних програм «Statgraph 2.0. », ”MicrosoftExel”. Рівень вірогідності складав 0,05 та 0,01.
Використані в дисертаційній роботі матеріали і методи були розглянуті та узгоджені з комісією з біоетики ІПКі К НАН України.
Динаміка показників ліпідного обміну в крові кролів при моделюванні експериментального атеросклерозу. За результатами проведеного біохімічного дослідження встановлено, що годування тварин протягом шести місяців холестерином привело до помірної гіперхолестеринемії з переважним зростанням атерогенних фракцій і зниженням рівня антиатерогенних ліпопротеїдів. Одержані результати при створенні моделі експериментального атеросклерозу в кролів співпадали з даннимилітератури (Аничков Н.Н., 1913, Климов А.Н., 1999).
Результати порівняльного аналізу біохімічних даних показали, що відмінаатерогенної дієти (АТД) приводило до 4-кратного зниження рівня ЗХС вже на першому тижні до 3,79±35 ммоль/л (табл.1). Зниження рівня ЗХС супроводжувалося зниженням концентрації ЛПНЩ до значень 2,67±0,25 ммоль/л. При падінні рівня ЗХС і ЛПНЩ збільшувалося концентрація ЛПВЩ до 0,35±0,03 ммоль/л і невірогідно зростали рівні ТГ і ЛПДНЩ у сироватці крові. На другому тижні зниження рівнів ЗХС і ЛПНЩ було вірогідним і становило 2,07±0,2 і 0,76±0,07 ммоль/л відповідно. При цьому рівні ТГ і ЛПДНЩ збільшувалися майже в 2 рази в порівнянні з першим тижнем. Рівень ЛПВЩ знижувався на 2-й тиждень і становив 0,16±0,01 ммоль/л, що впливало на КА (11,94±1,02).
До кінця 3-го тижня регресу показники рівня ЗХС незначно збільшилися (2,63±0,24 ммоль/л) відносно попереднього строку, при цьому відзначався феномен збільшення концентрації ЛПНЩ у порівнянні з 2-м тижнем експерименту (табл.1). Рівні ТГ і ЛПДНЩ також знизились майже в 2 рази й становили відповідно 1,49±0,11 і 0,68±0,05 ммоль/л.
У порівнянні з 2-м тижнем рівень ЛПВЩ підвищився у 2 рази, (0,32±0,02 ммоль/л) і майже досягав значень, які були установленіуінтактних тварин.
Дослідження показників ліпідного обміну після введення АКП виявило різке 5-кратне зниження рівня ЗХС вже на 1-му тижні у порівнянні з таким на піку атеросклероза. Рівень атерогенних ліпопротеїдів знижувався до 0,42±0,04 ммоль/л, що в 30 разів нижче, ніж на піку розвитку процесу. Значення ТГ і ЛПДНЩ були вищими, ніж при спонтанному регресі та склали 3,55±0,34 і 1,63±0,16 ммоль/л відповідно, тобто вищі в 2 рази у порівнянні з групою контролю (табл.1). Рівень антиатерогенних ліпопротеїдів на 1-му тижні знижувався й становив 0,28±0,02 ммоль/л. На 2-му тижні деяке зниження рівня ЗХС супроводжувалося зменшенням концентрації ТГ і ЛПДНЩ в 2 рази та приводило до 3-кратного зростання концентрації ЛПНЩ. До кінця 3-го тижня на тлі подальшого зниження ЗХС рівень ЛПВЩ досягав значень, встановлених у контрольних тварин. Вміст ТГ, ЛПДНЩ, ЛПНЩ знижувався, забезпечуючи КА 3,83±041, це значення було навіть нижчим, ніж у групі контрольних тварин.